本文選題：SIRT3　切入點：BH3模擬物　出處：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：多種不同類型的癌細胞包括卵巢癌細胞都擁有典型的癌代謝表型,即有“氧糖酵解”,表現(xiàn)為即便在氧氣充足的情形下,也更加依賴糖酵解代謝途徑產(chǎn)生ATP以供給能量。這一葡萄糖高度依賴的代謝特性,有利于促進癌細胞增殖,促使癌細胞逃避凋亡。在深入探究癌細胞代謝和凋亡相關性的過程中,有研究發(fā)現(xiàn)線粒體在受到代謝緊密控制的同時,能夠決定在應激過程中細胞的應答方式,最終發(fā)生適應性應激反應還是凋亡。值得注意的是,Bcl-2家族蛋白,作為一類重要的細胞凋亡調(diào)節(jié)因子,已經(jīng)被證明能夠影響線粒體形態(tài)及功能。靶向抑制Bcl-2的小分子化合物可通過競爭性結(jié)合抗凋亡Bcl-2蛋白,從而誘導多種癌癥細胞發(fā)生凋亡。新近的研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2家族蛋白不僅參與調(diào)控癌細胞凋亡,還與癌細胞的代謝過程有關。這些現(xiàn)象表明通過抑制Bcl-2抗凋亡蛋白發(fā)揮抗腫瘤作用,可能與癌細胞代謝的改變有關。SIRT3是去乙酰化酶sirtuin家族中定位于線粒體的一個關鍵酶。通過靶向催化底物蛋白發(fā)生去乙�；�,SIRT3參與調(diào)控細胞中的多種能量代謝途徑,包括呼吸鏈,三羧酸循環(huán),脂肪酸氧化和酮體生成過程。研究發(fā)現(xiàn)SIRT3還同代謝重編程有關,通過促使缺氧誘導因子HIF1-a去穩(wěn)定性失活,能夠控制糖酵解基因的表達。此外,SIRT3還參與了沉默Bcl-2誘導細胞發(fā)生凋亡的過程。這些發(fā)現(xiàn)提示SIRT3可能成為一個重要的癌癥治療靶點,同時參與調(diào)控癌細胞代謝和凋亡過程。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)新型廣譜Bcl-2抑制劑S1能夠抑制卵巢癌細胞生長,能夠誘導細胞發(fā)生線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑相關的凋亡。本研究以人卵巢癌SKOV3細胞為研究對象,從葡萄糖代謝的角度切入,探究了S1對卵巢癌細胞的損傷作用及其機制。研究發(fā)現(xiàn)去乙�；窼IRT3活化參與S1誘導的人卵巢癌細胞葡萄糖代謝紊亂過程,可發(fā)揮促進細胞死亡的作用。結(jié)合S1對癌細胞代謝作用的特點,提出了糖酵解抑制劑與Bcl-2抑制劑聯(lián)合應用治療卵巢癌的新方法。方法(1)MTT法檢測BH3模擬物S1對卵巢癌細胞SKOV3生存率的影響,卵巢癌移植瘤模型觀察S1藥物在體對卵巢癌細胞SKOV3生長的影響。(2)S1處理卵巢癌細胞SKOV3,采用Hoechst 33258染色觀察細胞核形態(tài);western blot法分析凋亡相關蛋白表達變化。(3)利用對O2和PH敏感的探針檢測細胞氧耗率和胞外泌酸率,葡萄糖氧化法和乳酸試劑盒分別測定培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸濃度,利用ATP試劑盒檢測細胞內(nèi)ATP水平。(4)采用PCR array法檢測人葡萄糖代謝通路84種相關基因變化,觀察S1對代謝各通路的整體影響。(5)采用LC/MS代謝組學技術(shù),檢測細胞內(nèi)代謝物變化,觀察S1對細胞代謝的整體影響,以及SIRT3活化對細胞代謝的影響。(6)q PCR法檢測SIRT3基因表達變化,Western blot方法檢測SIRT3蛋白表達變化,共聚焦免疫熒光技術(shù)檢測SIRT3與Tom20共定位;分離細胞核蛋白和線粒體蛋白,western blot法檢測SIRT3蛋白表達變化。(7)根據(jù)SIRT3的基因序列(Gen Bank:NM_012239)以及RNAi設計原理,構(gòu)建si-SIRT3質(zhì)粒,并通過western blot法進行驗證。si-SIRT3抑制SIRT3表達,MTT法檢測細胞生存率;western blot分析細胞內(nèi)凋亡相關蛋白Caspase3的表達;Caspase3/7熒光素酶試劑盒檢測Caspase3/7酶的活性。分離線粒體蛋白,western blot法檢測HK-II蛋白表達變化。(8)利用糖酵解抑制劑2-DG進行干預,MTT法檢測細胞生存率,western blot法檢測Caspase3、SIRT3蛋白的表達。結(jié)果(1)MTT檢測顯示,S1能夠劑量依賴性降低卵巢癌細胞SKOV3的存活率;體內(nèi)移植瘤模型檢測顯示,S1能夠有效抑制卵巢癌細胞體內(nèi)模型中的生長。(2)S1通過抑制Bcl-2、Mcl-1蛋白表達,誘導SKOV3細胞中細胞色素c釋放以及Caspase3活化,S1通過線粒體凋亡途徑誘導人卵巢癌細胞死亡。(3)對氧敏感探針和對p H敏感探針檢測結(jié)果顯示,S1能夠有效地抑制細胞氧耗率,同時胞外泌酸率有所增加。ATP檢測結(jié)果顯示S1能夠降低細胞內(nèi)ATP水平。(4)PCR array法檢測結(jié)果顯示,在短時間點(6h)人糖代謝信號通路中糖酵解相關基因表達下調(diào),線粒體氧化磷酸化和糖異生通路相關基因表達上調(diào),這表明S1在基因轉(zhuǎn)錄水平上對細胞糖代謝基因的表達有調(diào)節(jié)作用。(5)S1作用后,經(jīng)代謝組學檢測篩得代謝差異物146種,通過聯(lián)合PCR array基因變化數(shù)據(jù)進行代謝通路分析,發(fā)現(xiàn)人卵巢癌細胞中的三羧酸循環(huán)、糖酵解、糖異生以及磷酸戊糖途徑受影響最為顯著。(6)q PCR和Western blot法檢測顯示SIRT3基因和蛋白水平表達上調(diào),熒光共聚焦結(jié)果顯示S1能夠引起Tom20發(fā)生點狀聚集,SIRT3與Tom20共定位水平增加;同時細胞核內(nèi)SIRT3表達水平下降,提示S1誘導SIRT3亞細胞定位發(fā)生了改變,由細胞核轉(zhuǎn)位至線粒體。(7)構(gòu)建si-SIRT3重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染SKOV3細胞,抑制SIRT3表達,能夠降低S1對SKOV3細胞的損傷作用,細胞凋亡相關蛋白表達下調(diào),細胞凋亡水平下降。同時,抑制SIRT3能夠降低S1對葡萄糖攝入和乳酸分泌的抑制作用。人卵巢癌細胞沉默SIRT3表達,在S1作用下,經(jīng)代謝組學檢測篩選得到代謝差異物137種,發(fā)現(xiàn)SIRT3活化主要對人卵巢癌SKOV3細胞中的丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝通路、氮代謝通路、氨酰基轉(zhuǎn)移核糖核酸合成通路等影響最為顯著。(8)合用糖酵解抑制劑2-DG和S1,可以降低細胞存活率,同時引起凋亡蛋白和SIRT3蛋白表達上調(diào)。結(jié)論本研究以人卵巢癌細胞株SKOV3為研究對象,發(fā)現(xiàn)S1在體內(nèi)外研究模型中均能有效抑制卵巢癌細胞的生長。S1能夠誘導卵巢癌細胞發(fā)生凋亡,同時擾亂細胞糖代謝,主要表型為抑制線粒體有氧呼吸和糖酵解。去乙酰化酶SIRT3活化參與了S1對卵巢癌細胞凋亡的誘導和對細胞葡萄糖代謝的調(diào)節(jié),抑制SIRT3可以降低SKOV3細胞中S1誘導的凋亡水平,同時降低S1對SKOV3細胞糖酵解的抑制作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn),降低SIRT3的表達能夠調(diào)節(jié)糖酵解關鍵酶HK-II在線粒體中的表達水平,提示SIRT3可能通過影響HK-II的定位參與調(diào)節(jié)細胞凋亡和代謝。抑制糖酵解可通過進一步上調(diào)SIRT3表達,促進卵巢癌細胞SKOV3中S1誘導的凋亡水平。本文首次從細胞代謝的角度探討了BH3模擬物S1在卵巢癌細胞中的抗腫瘤作用,SIRT3可能通過調(diào)節(jié)糖酵解關鍵酶HK-II在細胞中的定位,參與了S1對卵巢癌細胞凋亡和代謝的調(diào)控;SIRT3可能是卵巢癌治療過程中的新靶點,通過調(diào)節(jié)人卵巢癌細胞葡萄糖代謝過程,可發(fā)揮促進細胞凋亡的作用。結(jié)合S1對癌細胞代謝的作用特點,提出了糖酵解抑制劑與Bcl-2抑制劑合加治療卵巢癌的新方法。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31

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本文編號：1654485