本文選題：MDH2　切入點(diǎn)：PTEN　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：子宮內(nèi)膜癌是威脅婦女健康的三大生殖道腫瘤之一。在北美和北歐,子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤,占每年新發(fā)腫瘤病例的6%,腫瘤死亡病例的3%。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的地域性,發(fā)病率最高的是北美和北歐,其次為東歐和拉丁美洲,發(fā)病率最低的是亞洲和非洲。早期子宮內(nèi)膜癌總體生存率在74-91%,而晚期僅為20-26%。按照臨床表現(xiàn),病理學(xué)特征及預(yù)后等,子宮內(nèi)膜癌可以分為兩類,Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌通常以內(nèi)膜樣腺癌為主,由內(nèi)膜增生發(fā)展而來,常發(fā)生于生育年齡及絕經(jīng)后婦女,被認(rèn)為與無拮抗的雌激素暴露相關(guān),Ⅰ型內(nèi)膜癌預(yù)后較好;Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌以漿液性癌或透明細(xì)胞癌為代表,通常由萎縮內(nèi)膜發(fā)展而來,多發(fā)生于絕經(jīng)后婦女,是非雌激素依賴型,預(yù)后差。雌激素在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。無拮抗的雌激素暴露被公認(rèn)為是Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。大樣本研究也已證實(shí),無論Ⅰ型還是Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌,腫瘤組織中雌激素含量都高于正常組織。經(jīng)典的雌激素代謝理論認(rèn)為,雌激素通過與細(xì)胞核的雌激素受體ER結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子和下游信號(hào)通路發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng),這個(gè)過程通常需要數(shù)小時(shí)。事實(shí)上,雌激素還可以通過與細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體GPR30結(jié)合啟動(dòng)僅耗時(shí)數(shù)分鐘甚至數(shù)秒鐘的快速雌激素信號(hào)通路。我們之前的研究中已經(jīng)證實(shí),雌激素可以通過與GPR30的結(jié)合激活MAPK途徑促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖侵襲。分子生物學(xué)研究揭示了雌激素在促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展的生物學(xué)活動(dòng)中PTEN,PIK3CA,K-RAS,P53,P16等基因突變或失活以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象等的作用。研究表明,PI3K-AKT-PTEN-mTOR,Wnt-β-catenin等信號(hào)通路對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生存與增殖,基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)起到重要的調(diào)節(jié)作用。而腫瘤抑制因子PTEN在幾乎高達(dá)80%的子宮內(nèi)膜腺癌,近55%的子宮內(nèi)膜增生過長(zhǎng)病例中存在突變或失活。諸多研究數(shù)據(jù)提示,PTEN基因的突變是子宮內(nèi)膜癌病變?cè)缙诘闹虏∫蛩刂弧?0多年前,Otto Warburg提出了瓦氏效應(yīng),開啟了腫瘤代謝研究的新紀(jì)元。瓦氏效應(yīng)指出,即使在氧供充足的情況下,腫瘤細(xì)胞仍優(yōu)先選擇糖酵解的方式提供能量。眾所周知,有氧氧化可將一分子葡萄糖完全轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水,同時(shí)產(chǎn)生34分子ATP;而糖酵解途徑在生成乳酸的同時(shí),僅產(chǎn)生2分子ATP。腫瘤細(xì)胞選擇這種產(chǎn)能效率低的代謝方式的現(xiàn)象引起了人們的思考。Warburg認(rèn)為腫瘤細(xì)胞線粒體功能的損傷使其不得不選擇糖酵解途徑產(chǎn)能。然而,數(shù)十年來,越來越多的研究數(shù)據(jù)顯示,大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的線粒體功能并未受損,不僅如此,腫瘤細(xì)胞的線粒體中還發(fā)生了代謝重編程。在重編程過程中,代謝酶對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了重要的作用。它們發(fā)揮自身酶的催化作用,或是發(fā)生基因突變,亦或通過抑制細(xì)胞的死亡途徑等提高腫瘤細(xì)胞酵解途徑的代謝活性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲。近年來一些研究顯示,部分代謝酶不僅可以發(fā)揮酶的催化作用,還可以作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子直接調(diào)控腫瘤抑制基因,從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。蘋果酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的重要代謝酶。MDH催化蘋果酸與草酰乙酸的相互轉(zhuǎn)化。事實(shí)上,真核生物中,MDH通常有兩種亞型,MDH1和MDH2。MDH2參與線粒體TCA循環(huán),而MDH1通常參與蘋果酸-天冬氨酸穿梭。MDH在多種腫瘤組織中過表達(dá),如分化較差的消化系統(tǒng)鱗狀細(xì)胞癌,惡性副神經(jīng)節(jié)瘤,前列腺癌等。MDH在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),活性增加,通過提高癌細(xì)胞代謝率發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖的作用。有趣的是,一項(xiàng)關(guān)于MDH1與腫瘤抑制因子p53的關(guān)系的研究結(jié)果顯示,在無葡萄糖的環(huán)境下,MDH1通過與下游基因啟動(dòng)子的P53反應(yīng)元件相互作用反式激活抑癌基因P53的活性。敲除MDH1可顯著降低乙酰-p53轉(zhuǎn)錄激活組蛋白編碼與啟動(dòng)子結(jié)合。而且,MDH1還調(diào)節(jié)p53依賴的細(xì)胞周期停滯及凋亡。可見,MDH1可作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控抑癌基因的活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)希望通過科學(xué)研究探索蘋果酸脫氫酶MDH2與子宮內(nèi)膜癌抑制因子PTEN之間的關(guān)系,以及它們對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并初步探討雌激素膜受體GPR30在雌激素對(duì)MDH2和PTEN表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用,為進(jìn)一步研究子宮內(nèi)膜癌的能量代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)的第一部分,我們采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織和正常組織MDH2表達(dá)情況及表達(dá)部位。同時(shí),對(duì)臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,找出MDH2與子宮內(nèi)膜癌患者發(fā)病年齡,腫瘤的期別,級(jí)別,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征之間的關(guān)系,以揭示MDH2的表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌臨床病理方面的意義;第二部分,我們采用Realtime-PCR,Western-blot,細(xì)胞轉(zhuǎn)染,RNA干擾等方法研究MDH2和PTEN之間的相互影響,并用免疫熒光法直觀的展現(xiàn)MDH2與PTEN的表達(dá)部位與相互關(guān)系。第三部分,采用CCK8,流式細(xì)胞學(xué)分析,Transwell,凋亡檢測(cè),細(xì)胞轉(zhuǎn)染,RNA干擾等方法,分別研究MDH2和PTEN對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖,侵襲,轉(zhuǎn)移及凋亡等生物學(xué)行為的影響;第四部分,采用Realtime PCR法,研究雌激素,GPR30激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響。第一部分MDH2在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及臨床病理意義對(duì)60孔子宮內(nèi)膜癌組織芯片進(jìn)行蘇木素染色,結(jié)果顯示,子宮內(nèi)膜癌組織中,MDH2呈過表達(dá)狀態(tài),且其表達(dá)部位是細(xì)胞質(zhì)。對(duì)這34例子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本的臨床病理資料進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示MDH2的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的級(jí)別相關(guān)。這些數(shù)據(jù)提示MDH2可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。第二部分MDH2和PTEN間的相互關(guān)系構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒MDH2 RNAi敲減MDH2,從細(xì)胞水平和蛋白水平均檢測(cè)到PTEN表達(dá)的上升;而過表達(dá)質(zhì)粒GV219-MDH2則會(huì)使PTEN的表達(dá)水平下降。同樣的,用RNA干擾質(zhì)粒PTENRNAi敲減PTEN,MDH2在細(xì)胞水平和蛋白水平的表達(dá)都有所上升;而過表達(dá)質(zhì)粒GV219-PTEN則會(huì)使MDH2的表達(dá)下降。這些結(jié)果說明,MDH2和PTEN之間存在相互調(diào)節(jié)。免疫熒光檢測(cè)中,我們看到,MDH2和PTEN共同表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-A的細(xì)胞質(zhì)中。因此,二者很可能通過直接結(jié)合發(fā)揮相互調(diào)節(jié)作用,當(dāng)然這一猜想還有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。第三部分MDH2和PTEN對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒MDH2 RNAi及過表達(dá)質(zhì)粒GV219-MDH2,并分別轉(zhuǎn)染到子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1-A和AN3CA中。結(jié)果顯示,敲減MDH2抑制了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡;而過表達(dá)MDH2的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系A(chǔ)N3CA卻表現(xiàn)出增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)而凋亡減弱的情況。由此可見,MDH2促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的增殖侵襲,抑制其凋亡。類似的,我們?cè)俜謩e構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒PTEN RNAi和過表達(dá)質(zhì)粒GV219-PTEN并轉(zhuǎn)染內(nèi)膜癌細(xì)胞,結(jié)果顯示,敲減PTEN后,子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移的水平上調(diào),而凋亡卻受到抑制;相應(yīng)的,過表達(dá)PTEN后,內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖侵襲減弱,凋亡增強(qiáng)。這也再次證實(shí)了 PTEN作為腫瘤抑制因子阻礙子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生存侵襲的作用。第四部分雌激素對(duì)MDH2和PTEN表達(dá)的影響用雌激素,GPR30激動(dòng)劑G1和抑制劑G15分別刺激子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞,在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1-A(ER陽(yáng)性,GPR30陽(yáng)性)和AN3CA(ER陰性,GPR30陽(yáng)性)細(xì)胞系中,雌激素和G1刺激MDH2表達(dá)上升,而G15使MDH2表達(dá)下降。相反,雌激素和G1的刺激使PTEN表達(dá)下降而G15使其表達(dá)上升。由此,我們不難得出結(jié)論,雌激素對(duì)MDH2的表達(dá)上調(diào)及對(duì)PTEN的表達(dá)下調(diào),很可能是通過GPR30相關(guān)的信號(hào)通路完成的。綜上所述,MDH2很可能在雌激素的刺激下,通過GPR30相關(guān)的信號(hào)通路抑制PTEN的表達(dá),發(fā)揮促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖侵襲的作用。MDH2與PTEN相關(guān)性的探索為子宮內(nèi)膜癌代謝機(jī)制的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。更為深入的實(shí)驗(yàn)研究將揭示MDH2在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制中的作用方式。MDH2很可能成為臨床上診斷治療子宮內(nèi)膜癌的新的靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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1 何曉琳;錢慶;張澤;;腫瘤流行病學(xué)數(shù)據(jù)可視化分析[J];中華醫(yī)學(xué)圖書情報(bào)雜志;2016年01期

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本文編號(hào)：1633127