本文選題：AOPPs　切入點：子癇前期　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景 妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的全身性疾病,我國發(fā)病率為9.4%-10.4%,國外報道發(fā)病率為7%-12%。該疾病不但嚴重影響了母嬰健康,至今為止仍然是母嬰發(fā)病率及死亡率較高的主要原因。子癇前期(preeclampsia)是該疾病最常見的類型。流行病學調查結果顯示,子癇前期孕產婦的死亡率約為5%-10%,且圍產兒死亡率在子癇前期及子癇患者更高達33.9%-68.6%。子癇前期以妊娠20周以后首次出現高血壓、蛋白尿、水腫為主要特征,并可伴有全身多臟器的損害;病情嚴重者可能因抽搐、腦出血、肺水腫、心功能衰竭、彌漫性血管內出血而導致死亡。臨床上處理子癇前期的患者,主要以對癥治療和終止妊娠為主。由于缺乏明確的預測手段和防治對策,使子癇前期成為導致孕產婦死亡的第二大原因,也是導致圍產兒發(fā)病及死亡的主要原因。其發(fā)病機制是多因素的,且目前尚不十分明確�，F多數學者認為子癇前期的發(fā)生、發(fā)展的原因和過程可能與以下幾種因素和學說相關：免疫失衡機制,胎盤淺著床,血管內皮細胞損傷和胎盤滋養(yǎng)細胞缺血,胰島素抵抗,鈣平衡失調,遺傳因素、營養(yǎng)缺乏等。其中細胞功能損傷及凋亡均與氧化應激有著密切的關系。 現有部分研究表明氧化應激學說可能是子癇前期的重要機制之一。子癇前期患者體內氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡遭到了破壞；活性氧族(Reactive Oxygen Species, ROS)與抗氧化體系之間失去平衡。其中氧化作用明顯加強,而抗氧化作用則相對減弱,總平衡向氧化方向增強。其實在正常妊娠孕婦體內也存在著不等量的自由基及其產物,但是由于妊娠期孕婦體內抗氧化能力相應提高,二者之間仍處于平衡狀態(tài),正常的生理性妊娠不致于形成氧化應激。據文獻報道,蛋白、多肽、氨基酸對各種自由基及其相關氧化物相當敏感。在子癇前期患者體內,氧化產物增多(脂質過氧化物、蛋白氧化產物、核酸)而抗氧化能力降低,導致子癇前期患者體內呈現氧化應激狀態(tài)。氧化應激在許多與細胞功能受損相關的疾病中發(fā)揮著重要作用。由于子癇前期患者的缺血、缺氧可以導致大量的自由基生成、脂質、蛋白質過氧化物產生、內皮細胞損傷等；這種過程在子癇前期疾病發(fā)生發(fā)展的過程中呈正反饋且加重了氧化應激,導致了疾病進一步惡化發(fā)展。目前研究表明,蛋白質也是氧化應激攻擊的主要靶分子之一,主要表現為氨基酸殘基氧化、肽鏈斷裂或者蛋白質分子的交聯(lián)聚合、蛋白質的疏水性與對水解酶的抵抗力增強,從而使蛋白質喪失生物活性并易于沉積。細胞的損傷及功能失調是子癇前期疾病特征性病理變化之一,它也是子癇前期疾病多器官功能損傷的病理生理學基礎。許多子癇前期患者在臨床癥狀出現以前,胎盤的形態(tài)與功能方面的改變就已經出現,并且臨床上大部分子癇前期患者在胎盤娩出后其臨床癥狀和體征很快就隨之消失；這均表明了胎盤在子癇前期疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了關鍵作用�；A研究表明,子癇前期的發(fā)病機制可歸納為胎盤淺著床和全身血管內皮細胞的激活兩個階段；第一階段的胎盤血液灌注減少,產生過多的活性氧,造成氧化應激,導致孕婦血管內皮細胞損傷,從而引發(fā)第二階段全身血管內皮細胞的病理性損傷。全身血管內皮損傷和系統(tǒng)性炎癥反應又加重了機體的氧化應激失衡,最終導致了子癇前期的一系列臨床癥狀和體征。根據目前的臨床和基礎研究,我們有理由相信子癇前期是一種胎盤源性疾病,胎盤的氧化-抗氧化的失衡是其發(fā)病的不可或缺的環(huán)節(jié)。 晚期氧化蛋白產物(advanced oxidation protein products, AOPP)是一種新型的蛋白類氧化應激標志物,是氧化應激引起體內各種蛋白質氧化所形成的終末產物的總稱。它于1996年由Witko-Sarsat首次報道,于尿毒癥患者血漿中首次發(fā)現,在慢性腎功能衰竭患者的血漿中分離出來。它是血漿白蛋白被自由基和反應性氧系氧化后形成的雙酪氨酸蛋白交連產物,其主要成分來自于：血清白蛋白被自由基或反應性氧系(主要為中性粒細胞髓過氧酶產生的氯化氧化物)氧化而成。AOPP相對于既往普遍關注的脂質過氧化物標志而言,它形成早,存在時間長,更加穩(wěn)定,是反映蛋白氧化應激損傷的可信指標；同時也是氧化應激時重要的促炎癥因子,炎癥介質是參與細胞損傷的重要物質。體外研究已經證實,AOPP可通過不同途徑參與誘導腎臟足細胞凋亡、血管內皮細胞激活、胰島素抵抗等一系列病理生理過程。目前已經證實在高齡、慢性腎臟疾病、冠狀動脈疾病、糖尿病、代謝綜合征、多囊卵巢綜合征等等疾病患者中均存在慢性AOPP蓄積。該類人群在妊娠過程中與正常人群相比更容易出現早產、子癇前期、胎兒宮內生長受限、胎盤早剝、重復的胎兒丟失、宮內死胎等等妊娠并發(fā)癥。進一步而言,對于AOPP為何沉積于上述疾病患者的體內,其機制的研究也日漸深入和明晰。Hideaki Kaneda等的研究表明慢性冠狀動脈疾病與尿毒癥中一樣,血漿白蛋白發(fā)生了氧化,該類疾病患者的血漿中AOPP水平和尿毒癥患者血漿中同樣增高,并且AOPP水平與慢性冠狀動脈疾病的發(fā)生以及該類疾病的嚴重程度相關；該實驗證明了氧化應激可能與慢性冠狀動脈疾病的病理生理過程密切相關。Agnieszka Piwoman等學者研究發(fā)現,如妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病等均屬于復雜性代謝紊亂性疾病,其發(fā)病機制與活性氧的產生及抗氧化系統(tǒng)功能失衡有關,在糖尿病患者中TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)及SH(蠶絲水解物)水平均有不同程度的降低,而CO2、NH2及AOPP水平增高；AOPP的表達水平在Ⅱ型糖尿病患者、子癇前期患者血漿中明顯增高(本課題組前期實驗結果),可推測AOPP可能是一種評估糖尿病病人氧化應激介導蛋白損傷的有用指標。AOPP不僅僅是氧化應激的產物,它還可以引起單核細胞(中性粒細胞)的呼吸爆發(fā),從而誘導單核細胞產生更多的活性氧,正反饋誘導或加重氧化應激反應,使得機體呈現出一種持續(xù)氧化應激狀態(tài)。 胰高血糖素樣肽鏈-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)主要是由腸道內分泌L細胞分泌的多肽,作為一種安全、有效的促胰島素分泌劑越來越受到關注,它本是治療Ⅱ型糖尿病的一種新途徑。GLP-1除了廣為人知的促進胰島β細胞增值、抑制β細胞凋亡、促進胰島素分泌等等作用外；近些年的研究顯示其在抑制氧化應激中也承擔著重要的角色。它可以降低TNF-a等誘導的炎癥水平,以減少高凝狀態(tài)和炎癥反應對于細胞的損傷；此外,GLP-1可抑制單核細胞粘附于人的主動脈內皮細胞,減輕血管炎性損傷,組織冠狀動脈粥樣硬化及其相關疾病的進展。大量的臨床及實驗性研究資料表明,GLP-1保護細胞生理功能可能與抑制氧化應激有關,但是其機制尚未十分明確。研究表明,在胰島β細胞、心肌細胞、膽囊細胞中,GLP-1均表現出了明顯的抗氧化應激作用。那么在妊娠滋養(yǎng)細胞中,GLP-1是否具有抑制AOPP抗氧化應激的作用,其作用機制是否與PI13k/Akt信號傳導通路有關。這些問題將在本實驗中得到初步的探索性答案。 目前已發(fā)現子癇前期血漿AOPP水平明顯高于正常孕婦。因此我們推測孕婦胎盤AOPP蓄積可能是誘導滋養(yǎng)細胞損傷、功能障礙并引起子癇前期發(fā)生過程中新的致病物質。本研究從探討子癇前期孕婦胎盤中AOPP表達水平與子癇前期嚴重程度的相關性以及子癇前期患者胎盤AOPP高表達可能的臨床意義,作為切入點。在體外的細胞水平進行實驗探索性研究,旨在證明AOPP通過NADPH通路誘導妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡；以及GLP-1抑制AOPP誘導的凋亡及其機制。為進一步尋找子癇前期的發(fā)病原因及機制提供理論基礎。 第一部分AOPP在子癇前期與正常妊娠胎盤組織中的表達 【目的】通過測定AOPP在子癇前期患者和正常孕婦胎盤組織中的表達水平及其差異；探討AOPP與子癇前期發(fā)病機制的相關性；為進一步研究氧化應激在子癇前期發(fā)病機制中的信號轉導通路提供線索及切入點。 【方法】隨機選取2012年9月-2013年9月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院收治并以剖宮產方式分娩的子癇前期患者共50例,其中子癇前期輕度(mildpreeclampsia, MPE)25例,子癇前期重度(severe preeclampsia, SPE)25例；選取同期足月因社會因素行剖宮產分娩的孕婦50例作為對照組。運用免疫組織化學方法檢測子癇前期患者(實驗組)與正常妊娠孕婦(對照組)胎盤組織中AOPP的表達水平；測定切片平均灰密度值,半定量胎盤中AOPP的表達量。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數±標準差表示。組間比較采用ANOVA檢驗。P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。 [結果](1)正常孕婦組胎盤組織基本無染色。子癇前期組胎盤組織中均可見棕褐色陽性染色。子癇前期輕度組AOPP主要表達于絨毛合體滋養(yǎng)層,偶見于絨毛細胞滋養(yǎng)細胞。子癇前期重度組AOPP在絨毛合體滋養(yǎng)層細胞以及絨毛細胞滋養(yǎng)細胞中均明顯表達。(2)與對照組(30.746±6.99)相比,輕度子癇前期患者(64.056±9.63)胎盤組織中的AOPP表達水平明顯增高,且差異具有顯著性(F=415.39；P0.05)。與對照組(30.746±6.99)相比,重度子癇前期患者(97.516±13.72)胎盤組織中的AOPP表達水平亦明顯增高,差異具有顯著性(F=415.39；P0.05)。重度子癇前期患者胎盤組織中的AOPP表達水平高于輕度子癇前期患者胎盤組織中的表達量(F=415.39；P0.05)。 [結論]AOPP在子癇前期患者的胎盤中的主要表達位置為合體滋養(yǎng)層細胞以及絨毛細胞滋養(yǎng)細胞。子癇前期患者胎盤組織中AOPP的表達水平與正常妊娠孕婦胎盤中的表達相比,具有顯著性差異。本部分實驗結果提示孕婦胎盤中AOPP的表達增高是子癇前期的重要病理變化,追溯其根源可能與子癇前期疾病有關,同時AOPP誘導加重了子癇前期的發(fā)生和發(fā)展；進一步說明了子癇前期的發(fā)病機制是多因素多因子共同參與,相互作用的結果。 第二部分AOPP通過NADPH通路誘導妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡 [目的]通過一系列體外細胞水平的實驗室基礎研究,探討AOPP誘導妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡的機制。 [方法]采用Witko-Sarsat等介紹的方法制備AOPP。用ELISA試劑盒復孔檢測β-HCG的含量。用侵襲小室試驗檢測AOPP刺激后妊娠滋養(yǎng)細胞侵襲能力的變化。用Hoechst33258熒光法檢測凋亡。用Western Blotting檢測凋亡相關蛋白的表達以及檢測尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Adanine Dinucleotide Phosphate, NADPH)氧化酶亞基的表達。用活性氧分子(Reactive Oxygen Species,ROS)陰離子熒光探針,檢測AOPP對活性氧分子的影響和作用。所有數據代表三次以上的重復試驗結果,以均數±標準差表示,所有統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。多個樣本均數的比較采用One-Way ANOVA,方差齊時兩兩比較采用LSD,方差不齊時采用Dunnett's T3法,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。 [結果]可實現無內毒素的AOPP的制備。AOPP抑制妊娠滋養(yǎng)細胞β-HCG的分泌(MSA刺激組F=0.913, P=0.477;AOPP刺激組F=20.603,P=0.000)。AOPP抑制妊娠滋養(yǎng)細胞的侵襲能力(F=197.593;P=0.000)。AOPP組妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡率明顯升高(不同濃度刺激組,F=37.813,P=0.000;不同時間刺激組,F=24.318,P=0.000),apocynin阻斷AOPP此效應。AOPP誘導了體外的NADPH氧化酶及其相關亞基的活化(NOX2:F=21.318,P=0.000;NOX4:F=73.643,P=0.000;p47phox: F=126.678, P=0.000;p22phox:F=4.323, P=0.000),NADPH氧化酶的抑制劑apocynin可阻斷AOPP此效應。AOPP誘導凋亡相關蛋白的表達(p53:F=40.979,P=0.00;Bax:F=274.420, P=0.00;Bcl-2:F=38.881, P=0.00)。 AOPP在體外刺激了ROS的表達(F=38.277,P=0.00),apocynin可阻斷AOPP此效應。 [結論]這一部分的實驗研究證實,AOPP抑制P-HCG的分泌和妊娠滋養(yǎng)細胞的侵襲能力可能與胎盤淺著床(子癇前期發(fā)病機制中比較受肯定和公認的理論之一)的理論相符合,因此AOPP的高表達是不利于妊娠順利進行的。AOPP以時間和劑量的方式誘導了妊娠滋養(yǎng)細胞的凋亡,其途徑主要是通過NADPH通路。P53、Bax蛋白參與AOPP誘導的妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡,P53、Bax蛋白在NAPDH氧化酶下游。NADPH氧化酶抑制劑apocynin干預阻斷了AOPP誘導的細胞損傷。因此,AOPP誘導的妊娠滋養(yǎng)細胞NADPH氧化酶的活化以及產生的大量ROS是導致細胞損傷的重要因素之一,這一結論為臨床防治子癇前期等妊娠期相關病變提供了一定程度上的理論依據。 第三部分GLP-1抑制AOPP所誘導的凋亡及其機制 [目的]在本課題第二部分初步證實了AOPP誘導妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡的研究基礎上,通過GLP-1干預AOPP誘導妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡的作用,并檢驗其對凋亡相關分子及PI3K/Akt通路的影響,初步探討GLP-1對AOPP誘導細胞凋亡的影響及其分子機制。 [方法]CCK-8(cell counting kit-8)比色法測定細胞活力及增值能力。熒光顯微鏡檢測活性氧(ROS)的表達。ELISA法檢測細胞凋亡蛋白酶caspase-9,-3的活性。Western-blot檢測p-Akt等通路相關蛋白的表達。ELISA法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Cyto-C的表達。所有數據代表三次以上的重復試驗結果,實驗數據計量資料以均數±標準差表示,所有統(tǒng)計由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。多個樣本均數的比較采用One-Way ANOVA,方差齊時兩兩比較采用LSD,方差不齊時采用Dunnet's T3法,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。 [結果]在一定濃度范圍內(50-150nmol/L),GLP-1處理AOPP誘導的妊娠滋養(yǎng)細胞后進行實驗,結果表明GLP-1抑制AOPP誘導的妊娠滋養(yǎng)細胞內ROS的生成(P=86.222P=0.000)。GLP-1可部分減輕AOPP誘導caspase-9、 caspase-3活性的增加(caspase-9:F=10.321P=0.004; caspase-3:F=20.989,P=0.000)。LY294002作為P13K的抑制劑,可拮抗GLP-1對AOPP的以下作用：GLP-1抑制AOPP誘導的細胞活力下降(F=71.07,P=0.000)、GLP-1抑制AOPP誘導細胞p-Akt水平低表達(不同濃度刺激時F=10.679,P=0.004；不同時間刺激時F=45.886P=0.000),GLP-1抑制AOPP誘導細胞Bax(F=33.017P=0.00)、 cyto-c(F=49.483,P=0.00)高表達以及Bcl-2的低表達(F=45.258P=0.00)。 [結論]本實驗發(fā)現GLP-1在一定的濃度范圍內有拮抗AOPP抑制妊娠滋養(yǎng)細胞活力的作用,而且減少AOPP誘導的細胞損傷。AOPP作用于妊娠滋養(yǎng)細胞后,ROS水平升高,凋亡蛋白酶caspase-9、-3的活性增加,GLP-1可部分性減少AOPP誘導的上述效應。因此推測氧化應激、caspase-9、-3可能參與了GLP-1拮抗AOPP誘導的細胞凋亡的作用。GLP-1至少部分通過PI3k/Akt信號轉導通路發(fā)揮抗凋亡作用,減輕AOPP誘導的細胞凋亡。GLP-1可調節(jié)AOPP誘導妊娠滋養(yǎng)細胞內Bcl-2、Bax、cyto-c表達水平,且此調節(jié)作用與PI3K/Akt信號通路有關。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R714.244

【參考文獻】

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1 袁方,劉尚喜,田建偉;晚期氧化蛋白產物誘導內皮細胞產生活性氧[J];第一軍醫(yī)大學學報;2004年12期

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本文編號：1601303