本文選題：自噬通量　切入點：ATP　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：在卵巢癌的治療中,順鉑類化療藥物仍是其一線藥物,并取得了一些治療效果。隨著順鉑在卵巢癌治療中的廣泛應用,發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞逐漸對其產(chǎn)生耐受,這也是臨床卵巢癌治療的難點。順鉑主要是作用于細胞內的DNA,導致DNA損傷,進而導致細胞周期停滯和凋亡。文獻報道,內質網(wǎng)應激、自噬等細胞適應性反應可能參與了卵巢癌等腫瘤的順鉑耐受。自噬能隔離細胞質中的成分,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解細胞內損傷的細胞器及堆積的蛋白質,為細胞代謝提供物質。在正常的生理或者藥物刺激條件下,自噬保護腫瘤細胞免于化療藥物誘導的細胞凋亡。也有研究表明,過度或者持續(xù)的自噬導致腫瘤細胞死亡。自噬在腫瘤細胞中可能發(fā)揮雙重作用,但其準確的作用機制仍然存在爭議。自噬是溶酶體依賴的過程,并且在自噬末端需要與溶酶體融合形成自噬溶酶體,保障自噬通量順利進行,同時自噬體與溶酶體的融合需要消耗大量溶酶體。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)自噬可能參與了腫瘤細胞化療藥物如順鉑的耐受。而溶酶體功能與數(shù)量的維持對自噬通量是至關重要的,因此我們推測自噬-溶酶體可能與腫瘤細胞的化療藥物耐受有關。研究發(fā)現(xiàn)在溶酶體內含有豐富的ATP,由于溶酶體也是細胞的降解中心,其腔內較低的p H環(huán)境和水解酶對溶酶體的降解功能至關重要,而ATP可為溶酶體內酸性環(huán)境和其內水解酶活性提供所需的能量。具有較低p H的溶酶體腔是溶酶體內水解酶活化的最佳環(huán)境,V-ATP酶對溶酶體酸性環(huán)境的維持具有重要作用,而V-ATP酶蛋白質復合物功能的維持需要ATP提供能量。溶酶體內部分水解酶的高表達也與腫瘤有關,尤其是惡性腫瘤中常高表達Cathepsin D;若其缺陷可誘導細胞死亡;而Cathepsin D在溶酶體內發(fā)揮活性需要ATP為其提供能量。溶酶體功能受損時,降低自噬溶酶體的功能,甚至影響自噬溶酶體融合,嚴重時溶酶體內的水解酶可被釋放至細胞質中,觸發(fā)細胞凋亡。我們推測減少溶酶體內ATP可能會導致溶酶體功能受損,降低自噬溶酶體功能,影響自噬通量,因而溶酶體內ATP可能是調控腫瘤細胞化療藥物耐受的重要決定因素。本研究以人卵巢癌細胞SKOV3細胞(親代)和SKOV3/DDP細胞(順鉑耐受)為研究對象,基于ATP調控溶酶體探討自噬通量在卵巢癌順鉑耐藥的作用及機制,為腫瘤化療藥物耐受的治療提供新的策略。方法:⑵MTT法檢測順鉑對人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細胞存活率的影響。⑵順鉑處理人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細胞后,通過Western blot檢測Cleaved Caspase-3,p62,LC3,LAMP1,Cathepsin D表達;間接免疫熒光方法觀察p62與LC3或Ub的共定位。⑶利用激光共聚焦顯維鏡觀察SKOV3和SKOV3/DDP細胞中LTR著色的變化,和LAMP1與LC3共定位。⑷利用Cathepsin D活性試劑盒,檢測SKOV3和SKOV3/DDP細胞中Cathepsin D活性的改變。⑸利用自噬抑制劑3-MA或CQ,抑制自噬后,MTT法檢測SKOV3/DDP細胞存活率的變化;通過Western blot檢測p62,LC3,Ub,Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3,Cathepsin D和t Bid的表達;激光共聚焦顯維鏡觀察LAMP1與LC3共定位,LTR著色的變化;Cathepsin D活性試劑盒檢測Cathepsin D活性的改變;流式細胞術測量細胞凋亡率。⑹Cathepsin D活性抑制劑Pep A抑制Cathepsin D活性后,Western blot檢測p62,LC3和Ub的表達;Cathepsin D活性試劑盒檢測Cathepsin D活性變化;間接免疫熒光的方法檢測LAMP1與LC3共定位。⑺利用激光共聚焦顯微鏡,通過Quinacrine染色檢測細胞中溶酶體內ATP;利用DIDS抑制溶酶體內ATP聚集,通過激光共聚焦顯微鏡觀察LTR染色的變化;Western blot檢測p62和LC3表達;間接免疫熒光的方法檢測LAMP1與LC3共定位。結果1.與SKOV3細胞相比,SKOV3/DDP細胞對順鉑相對不敏感;順鉑可以誘導SKOV3和SKOV3/DDP細胞LC3-II表達增加;與SKOV3細胞相比,順鉑作用SKOV3/DDP細胞12h時,LC3-II蛋白表達較高,同時間接免疫熒光也觀察到大量點聚集的p62和LC3共定位,提示順鉑可以誘導SKOV3和SKOV3/DDP細胞發(fā)生自噬,相比SKOV3細胞,SKOV3/DDP細胞中自噬水平較高。2.與SKOV3細胞相比,在SKOV3/DDP細胞中,無論有無順鉑處理,溶酶體膜標志蛋白LAMP1及溶酶體內Cathepsin D表達較高;且順鉑誘導SKOV3/DDP細胞溶酶體內LTR著色增強,Cathepsin D活性增高。3.與自噬抑制劑3-MA和順鉑聯(lián)合應用相比,靶向溶酶體的自噬抑制劑CQ與順鉑的聯(lián)合應用更加明顯地減少SKOV3/DDP細胞的存活率,引起LC3-II,p62和泛素化蛋白表達增加,減弱細胞內LTR著色,降低Cathepsin D活性,甚至發(fā)生線粒體途徑凋亡。4.在SKOV3/DDP細胞中,Cathepsin D活性抑制劑Pep A和順鉑的聯(lián)合,明顯地降低了Cathepsin D活性,減弱LTR著色,同時也上調了p62,LC3-II和泛素化蛋白的表達水平。5.相對SKOV3細胞,SKOV3/DDP細胞中含有更加豐富的ATP;DIDS抑制SKOV3/DDP細胞的溶酶體內ATP聚集后,明顯地減少了細胞中溶酶體內ATP的含量,同時上調了p62和LC3-II蛋白的表達,增加了LAMP1和LC3的共定位,減弱了LTR著色,降低Cathepsin D活性。結論:1.順鉑能夠誘導卵巢癌細胞發(fā)生自噬,相對于SKOV3細胞,SKOV3/DDP細胞中自噬水平較高;與SKOV3細胞相比,在SKOV3/DDP細胞中,無論有無順鉑處理,溶酶體膜標志蛋白LAMP1及溶酶體內Cathepsin D表達較高;順鉑誘導SKOV3/DDP細胞溶酶體內LTR著色增強和Cathepsin D活性升高,說明相對SKOV3細胞,SKOV3/DDP細胞內含有較豐富的溶酶體和Cathepsin D,這些結果提示自噬-溶酶體途徑可能與卵巢癌細胞的順鉑耐受有關。2.靶向溶酶體的自噬抑制劑CQ與順鉑的聯(lián)合應用比早期階段自噬抑制劑3-MA和順鉑聯(lián)合應用,更加明顯地減少SKOV3/DDP細胞的存活率,增加p62,LC3-II和泛素化蛋白的表達,減弱LTR著色和降低Cathepsin D活性,引起自噬溶酶體的蓄積,甚至觸發(fā)線粒體途徑凋亡,說明通過干擾溶酶體功能而抑制自噬通量增加了SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性,提示自噬保護卵巢癌細胞免于順鉑誘導的凋亡,而且溶酶體可能通過調控自噬通量參與卵巢癌的順鉑耐受。3.相對SKOV3細胞,SKOV3/DDP細胞中含有較豐富的Cathepsin D;抑制溶酶體內Cathepsin D的活性,可增加自噬相關蛋白p62,LC3-II的表達,降低溶酶體內LTR著色和Cathepsin D活性,提示溶酶體內Cathepsin D可能通過維護溶酶體的降解功能保障自噬通量,參與卵巢癌的順鉑耐受。4.對比SKOV3細胞,SKOV3/DDP細胞的溶酶體內含有較豐富的ATP,DIDS抑制SKOV3/DDP細胞的溶酶體內ATP聚集,明顯地增加了自噬相關蛋白的表達,降低溶酶體內LTR著色和Cathepsin D活性,甚至引起自噬溶酶體蓄積,提示減少溶酶體內ATP不僅影響溶酶體,也可能干擾自噬溶酶體的降解功能,進而調控自噬通量參與卵巢癌細胞的順鉑耐受。本實驗首次通過ATP調控溶酶體探討自噬通量在卵巢癌順鉑耐藥中的作用及機制,為克服腫瘤細胞化療藥物耐受提供新的策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31

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本文編號：1595201