發(fā)布時(shí)間：2018-03-10 19:19

  本文選題：N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅲ　切入點(diǎn)：N-糖基化　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：妊娠早期,滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附并侵入母體子宮內(nèi)膜是胚胎著床和胎盤形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅲ(N-acetylglucosaminyltransferase Ⅲ, GnT-Ⅲ)是N-糖基化修飾的一個(gè)關(guān)鍵酶,GnT-Ⅲ及其催化產(chǎn)物平分型糖支鏈結(jié)構(gòu)(bisecting N-acetylglucosamine, bisecting GlcNAc)參與調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲,但GnT-Ⅲ及其催化產(chǎn)物平分型糖支鏈結(jié)構(gòu)在人妊娠各時(shí)期的胎盤發(fā)育、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲過程中的功能及作用機(jī)制尚不清楚。此外,已有文獻(xiàn)報(bào)道a5β1整合素上糖基化修飾的改變可引起腫瘤細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲行為的改變。目的：本研究旨在通過比較人正常妊娠不同時(shí)期胎盤組織中GnT-Ⅲ及其催化產(chǎn)物平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)的表達(dá)和分布差異,以及用小干擾RNA法(small interfering RNA, SiRNA)在人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3中建立MGAT3基因(編碼GnT-Ⅲ)沉默模型,來探索GnT-Ⅲ和平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)對功能蛋白α5β1的N-糖基化修飾和滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的調(diào)控,為臨床不孕癥和自然流產(chǎn)等疾病診治探尋新的分子靶點(diǎn)。方法：1.我們分別采用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光法檢測GnT-Ⅲ,用生物素化的蠶豆紅細(xì)胞凝集素(biotinylated phaseolus vulgaris erythroagglutinin, PHA-E)印跡、PHA-E凝集素組織化學(xué)及PHA-E凝集素?zé)晒夥z測GnT-Ⅲ的催化產(chǎn)物平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)在人正常妊娠各階段的胎盤組織和不同的人滋養(yǎng)層細(xì)胞株中的表達(dá)和分布；2.用SiRNA法在人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3中建立MGAT3基因沉默模型,運(yùn)用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、transwell細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞外基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)技術(shù)分析沉默MGAT3基因?qū)?xì)胞增殖、遷移、侵襲及與細(xì)胞外基質(zhì)黏附等生物學(xué)效應(yīng)的影響,用qRT-PCR、蛋白質(zhì)印跡、免疫共沉淀技術(shù)分析沉默MGAT3基因?qū)Ζ?β1整合素的表達(dá)和糖基化修飾的影響,并用蛋白質(zhì)印跡法初步分析相關(guān)信號通路的變化。結(jié)果：1.在人正常妊娠絨毛組織中,GnT-Ⅲ主要表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(cytotrophoblasts, CTBs)和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞(syncytiotrophoblasts, STBs)的細(xì)胞質(zhì),且在妊娠前三個(gè)月的表達(dá)強(qiáng)于妊娠中三個(gè)月(P0.05)和妊娠后三個(gè)月(P0.05)；GnT-Ⅲ的催化產(chǎn)物平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)在妊娠前三個(gè)月絨毛中的含量顯著高于妊娠后三個(gè)月(P0.05)。2. GnT-Ⅲ在絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous cytotrophoblasts, EVTs)中高表達(dá),且在有EVTs侵入的蛻膜組織也呈高表達(dá),而在無EVTs侵入的蛻膜組織中表達(dá)很弱甚至無表達(dá),并且GnT-Ⅲ在有EVTs細(xì)胞侵入的蛻膜組織中妊娠前三個(gè)月的表達(dá)高于妊娠后三個(gè)月。3. PHA-E凝集素組織化學(xué)分析結(jié)果顯示平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)主要分布在滋養(yǎng)層細(xì)胞的表面,且在妊娠前三個(gè)月絨毛中大量分布,在足月胎盤絨毛中分布較少,且妊娠前三個(gè)月高于妊娠后三個(gè)月(P0.05)。4.用SiRNA法在人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3中沉默MGAT3基因(編碼GnT-Ⅲ), JEG-3細(xì)胞在MGAT3基因沉默后其增殖能力未受到明顯影響,而細(xì)胞遷移、侵襲能力以及與細(xì)胞外基質(zhì)黏附能力明顯下降;MGAT3基因沉默后α5β1整合素的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變,但α5β1整合素上的平分型糖支鏈含量明顯減少。5. Western blot分析結(jié)果顯示沉默MGAT3基因后ERK和FAK的磷酸化水平下調(diào)。結(jié)論：該研究結(jié)果提示,GnT-Ⅲ在調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞正常遷移、侵潤過程中扮演重要角色,α5β1整合素的糖基化修飾可能參與了這一調(diào)節(jié)過程,深入的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究和探索。
[Abstract]:Background: early pregnancy, adhesion of trophoblast cells invade the maternal endometrium and embryo implantation and placental formation is the key link of.N- N-acetylglucosaminyltransferase III (N-acetylglucosaminyltransferase III, GnT- III) is a key enzyme of N- glycosylation, GnT- III and its catalytic product of split type sugar chain structure (bisecting N-acetylglucosamine, bisecting GlcNAc) involved in the regulation of tumor invasion and metastasis, but GnT- III and its catalysate split type sugar branched structure developed in human placenta at different period of pregnancy, trophoblast invasion function and mechanism of action in the process is not clear. In addition, it has been reported that A5 beta 1 integrin on glycosylation changes can cause aggressive behavior tumor cells and trophoblast cells. Objective: This study aims to compare the human placental tissue in different periods of GnT- III and its catalytic normal pregnancy The expression and distribution of difference products bisecting GlcNAc structure, and the use of small interfering RNA (small interfering RNA, SiRNA) to establish MGAT3 gene in human choriocarcinoma cell line JEG-3 (encoding GnT- III) silence model, to explore the regulation of GnT- type III peace GlcNAc structure on the function of protein alpha 5 beta 1 invasion N- sugar group modification and trophoblast cells, explore new molecular targets for clinical diagnosis and treatment of infertility and spontaneous abortion and other diseases. Methods: 1. we used immunohistochemistry, real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR), Western blotting, immunofluorescence detection of GnT- III, with bean red blood cell agglutinin biotinylated (biotinylated Phaseolus vulgaris erythroagglutinin, PHA-E blot, GnT- PHA-E III) detection of lectin histochemistry and PHA-E lectin fluorescence catalysate bisecting GlcNAc structure in human placenta tissue of normal pregnancy stages And human trophoblast cell lines with different expression and distribution in 2.; with the method of SiRNA in human choriocarcinoma cell line JEG-3 to establish model of MGAT3 gene silencing, the proliferation of CCK-8 cells, Transwell cell migration and invasion assay, analysis of silencing MGAT3 gene transfer on cell proliferation, the experimental technology of extracellular matrix adhesion, invasion and cell the biological matrix adhesion effect by qRT-PCR, Western blotting, immunoprecipitation expression and glycosylation analysis of MGAT3 gene silencing on the alpha 5 beta 1 integrin modifications, and changes in signal pathways related to a preliminary analysis by Western blotting. Results: 1. in normal pregnancy tissue, GnT- III mainly expressed in trophoblast cells (cytotrophoblasts, CTBs) and trophoblast cells (syncytiotrophoblasts, STBs) in the cytoplasm, and strong expression in the first three months of pregnancy Three months of pregnancy (P0.05) and after three months of pregnancy (P0.05); catalysate bisecting GlcNAc GnT- III in the first three months of pregnancy villi were significantly higher than those after three months of pregnancy (P0.05).2. GnT- III in extravillous trophoblast cells (extravillous, cytotrophoblasts, EVTs) in high expression and also showed high expression and EVTs in the invasion of decidual tissue, while no EVTs invade the decidua expressed little or no expression of GnT- and EVTs in cell invasion in decidua of pregnancy expression three months before than after three months of pregnancy.3. PHA-E lectin histochemical analysis results showed that the surface split type GlcNAc structure is mainly distributed in the trophoblast cells, and a large number of distribution in the first three months of pregnancy villi, less distribution in term placenta in pregnancy and three months before more than three months after pregnancy (P0.05).4. by SiRNA method in human chorionic villi Membrane cancer cell line JEG-3 in silencing the MGAT3 gene (encoding GnT- III), in JEG-3 cells after MGAT3 gene silencing and its proliferation ability was not affected, and the cell migration, invasion and adhesion to extracellular matrix decreased significantly; no significant change in the expression level of MGAT3 gene silencing alpha 5 beta 1 integrin mRNA transcription level but the split type sugar and protein, branched chain alpha 5 beta 1 integrin on the content of.5. significantly decreased Western blot analysis results showed that the down-regulation of ERK and FAK phosphorylation after MGAT3 gene silencing. Conclusion: the results of this study suggest that GnT- of the normal migration in the regulation of trophoblast cells, play an important role in the process of invasion, glycosylation modification of alpha 5 beta 1 integrin may participate in the regulating process, in-depth mechanism still needs further study and exploration.

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714

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本文編號：1594710