本文選題：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9　切入點：體外受精-胚胎移植　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:在體外受精-胚胎移植(In vitro ferti1ization-embryo transfer,IVF-ET,IVF)過程中,能夠準確判斷卵母細胞成熟度對于受精、胚胎發(fā)育、妊娠的建立以及胎兒發(fā)育具有深刻的影響。提高卵母細胞成熟度對改善IVF妊娠結(jié)局具有重大意義。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9(Bone morphogenetic protein-9,BMP-9)是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族(Bone morphogenetic protein,BMP)中的一種,大量存在于肝臟,具有誘導(dǎo)和維持胚胎神經(jīng)元的類膽堿分化、調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸代謝、調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的動態(tài)平衡等多種重要功能,是目前已知的BMPs中誘導(dǎo)成骨能力最強的因子。近期有研究發(fā)現(xiàn)BMP-9在大鼠原始顆粒細胞對類固醇生成存在作用,因此我們推測BMP-9可能存在人卵巢顆粒細胞中并參與生殖系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。本研究檢測IVF-ET助孕患者顆粒細胞中BMP-9水平,分析其與年齡、體重指數(shù)(Body mass index,BMI)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率,卵子利用率之間的關(guān)系,探討B(tài)MP-9對卵子質(zhì)量、受精及胚胎發(fā)育的影響。方法:選取2015年4月至2015年7月于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院生殖醫(yī)學科接受常規(guī)IVF-ET,采用長方案控制性促排卵治療的患者作為研究對象,共85例。年齡20-38周歲;竇卵泡數(shù)≥7個;月經(jīng)周期規(guī)律。采用免疫細胞化學法檢測BMP-9在顆粒細胞中的表達定位,逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測顆粒細胞中BMP-9 m RNA和蛋白的表達水平�？刂菩源倥怕阎委�:患者均采用長方案治療,于黃體期中期開始用藥,皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑(Gonadotrophin releasing hormone agonist,Gn RHa)1.4mg,第14天測定血清卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)、雌二醇(Estradiol,E2)水平,并B超下監(jiān)測卵泡大小及子宮內(nèi)膜(Endometrium,EM)厚度,達到降調(diào)節(jié)水平(LH≤2.5IU/L,FSH≤3IU/L,E2≤30pg/ml,EM≤5mm),后給予重組人促卵泡激素注射液(r-FSH)150-225IU促排卵,超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜及卵泡生長情況,必要時抽取肘靜脈血監(jiān)測LH、E2、孕激素(Progesterone,P)水平,當有2個卵泡直徑大于20mm,且血清E2水平為每個卵泡約200-300pg/ml時,當晚注射艾澤250μg(重組人絨促性素注射液,意大利)。36-37h后經(jīng)陰道超聲指導(dǎo)下取卵。卵母細胞及胚胎評價:評估卵子顆粒細胞復(fù)合體采用MⅡ卵評分系統(tǒng)。受精后16~20小時采用SCOTT合子評分標準,觀察受精卵的原核形態(tài)。受精卵繼續(xù)培養(yǎng)48小時,采用卵裂期胚胎評分標準進行評分,檢查胚胎發(fā)育情況。顆粒細胞采集:留取全部卵泡液,收集細胞沉淀。50%的Percoll細胞分離液分離顆粒細胞,紅細胞裂解液裂解殘留的紅細胞,PBS洗滌后離心,下層即為顆粒細胞。部分顆粒細胞加入2ml Trizol液完全裂解后置于-80℃凍存,用于RT-PCR實驗;部分-80℃直接凍存,用于Western blot實驗;另留取少量顆粒細胞涂片,4%多聚甲醛固定后用于免疫細胞化學實驗。免疫細胞化學法:對顆粒細胞進行固定及透化處理;封閉內(nèi)源性過氧化物酶及非特異性結(jié)合位點。一抗采用兔抗人多克隆BMP-9抗體(山羊血清按照1:200)(ABCAM),陰性對照以PBS代替一抗,并按照免疫細胞化學法進行檢測。Leica顯微照相系統(tǒng)進行圖像懫集。RT-PCR技術(shù):Trizol法提取顆粒細胞中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄采用PROMEGA試劑盒,按照說明書進行。以β-actin為內(nèi)參,將目的基因擴增。產(chǎn)物于20g/L的瓊脂糖凝膠電泳,目的基因與內(nèi)參擴增產(chǎn)物電泳條帶亮度密度比值為BMP-9 m RNA的相對表達量。Western Blot:細胞裂解液裂解顆粒細胞;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳;分離蛋白條帶,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;5%脫脂奶粉封閉1小時;將PVDF膜放入BMP-9抗體工作液(1∶1 000)中,4℃過夜;TBST洗膜三次;加二抗孵育1小時,用TBST液洗膜三次。β-actin為內(nèi)參。用雙色紅外激光掃描器進行掃描,記錄灰度值,目的條帶與內(nèi)參照的光密度比值為BMP-9蛋白的相對表達量。統(tǒng)計分析:所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用`x±s表示,組間差異采用t檢驗,P0.05即有顯著性差異。對相關(guān)的計量資料采用Person相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性分析。結(jié)果:1 BMP-9定位表達于人顆粒細胞胞漿,個體間表達水平有差異(圖1)。2顆粒細胞中BMP-9m RNA的表達2.1顆粒細胞中BMP-9m RNA的表達同患者的年齡、BMI、b FSH、b LH、GN總量、GN天數(shù)均無直線相關(guān)關(guān)系(表1)。2.2顆粒細胞中BMP-9m RNA表達同患者的獲卵數(shù)、受精數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、卵子利用率均無直線相關(guān)關(guān)系(表2)。3顆粒細胞中BMP-9蛋白的表達3.1顆粒細胞中BMP-9蛋白的表達個體水平間存在差異(圖2)。3.2顆粒細胞中BMP-9蛋白的表達同患者的年齡、BMI、b FSH、b LH、GN總量、GN天數(shù)均無直線相關(guān)關(guān)系(表1)。3.3顆粒細胞中BMP-9蛋白表達同患者的獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、受精數(shù)、2PN數(shù)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、卵子利用率均無直線相關(guān)關(guān)系(表2)。4顆粒細胞中BMP-9 m RNA表達同蛋白表達的相關(guān)系數(shù)為0.220,P=0.043,存在相關(guān)關(guān)系(圖3)。5根據(jù)BMP-9 m RNA的相對表達量(0.155-0.690),選取均數(shù)0.403為節(jié)點,分為低表達組(n=41)和高表達組(n=44)(圖4),兩組間基礎(chǔ)資料無統(tǒng)計學差別(表3)。BMP-9m RNA高表達組優(yōu)質(zhì)胚胎率、卵子利用率高于低表達組,有統(tǒng)計學差別(P0.05)(表4)。結(jié)論:1 BMP-9 m RNA及蛋白在人類卵巢顆粒細胞中均有表達。BMP-9蛋白表達于顆粒細胞胞漿中,可能作為自分泌/旁分泌因子參與生殖系統(tǒng)調(diào)控。2 BMP-9 m RNA同蛋白質(zhì)的表達具有直線相關(guān)關(guān)系。3 BMP-9高表達可提高優(yōu)質(zhì)胚胎率,改善卵母細胞質(zhì)量,說明BMP-9或可成為評估卵子質(zhì)量的指標之一。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714.8

【參考文獻】

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1 趙杰;陳秀娟;;顆粒細胞與卵母細胞關(guān)系研究進展[J];國際生殖健康/計劃生育雜志;2015年05期

2 歐陽效晴;張春強;栗瑞蘭;張通;范曉梅;高麗霞;趙o，

本文編號：1587381