本文選題：卵巢癌　切入點(diǎn)：缺氧誘導(dǎo)因子-1α　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率在各類婦科腫瘤中位居首位,嚴(yán)重威脅了婦科腫瘤患者的生命。雖然多年來卵巢癌的診斷和治療手段已得到顯著提高,但是卵巢癌的患者5年生存率仍僅為30%。卵巢癌患者的死因多是由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,然而對于卵巢癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病理機(jī)制我們尚未完全清楚。因此,研究卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制并探索一個有效的監(jiān)測指標(biāo)對于卵巢癌的診治是十分必要的。缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的基本特征之一,在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。大量體外實(shí)驗(yàn)證明了缺氧能夠產(chǎn)生和誘導(dǎo)某些蛋白酶,從而降解細(xì)胞外基質(zhì);臨床研究也表明腫瘤缺氧與腫瘤轉(zhuǎn)移傾向有一定的關(guān)系。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1 α(Hypoxia-inducible factor-1 α)是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的核心因子,在缺氧環(huán)境中表達(dá)上調(diào),參與了腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。HIF-1 α與多種腫瘤關(guān)系已經(jīng)得到證實(shí),但對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響尚未得到闡明。本研究將選擇卵巢癌A2780細(xì)胞來檢測缺氧環(huán)境下HIF-1 α對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。研究方法:1.采用乏氧培養(yǎng)箱模擬腫瘤低氧微環(huán)境,分別在常氧和缺氧的環(huán)境中培養(yǎng)卵巢癌A2780細(xì)胞;2.通過實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡(western blot)檢測缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)mRNA及蛋白的在常氧和缺氧環(huán)境中的表達(dá)情況;3.應(yīng)用小干擾 RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染卵巢癌 A2780 細(xì)胞,通過顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,并通過RT-PCR驗(yàn)證siRNA對A2780細(xì)胞HIF-1α基因抑制結(jié)果;4.通過 RT-PCR 和 western blot 檢測 siRNA 干擾 HIF-1 α 基因后 MMP13 mRNA 及蛋白的表達(dá)變化;5.通過對穿過Transwell小室人工基底膜的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì),比較常氧環(huán)境下與缺氧環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,以及siRNA干擾HIF-1α基因前后卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.卵巢癌A2780細(xì)胞中HIF-1α mRNA在正常氧環(huán)境中可見表達(dá),HIF-1α的mRNA水平隨缺氧時間的延長,表達(dá)水平逐漸升高;正常氧環(huán)境中HIF-1α蛋白表達(dá)較少,經(jīng)缺氧培養(yǎng)后,A2780細(xì)胞中HIF-1α的蛋白含量明顯增多,在缺氧處理24 h后其蛋白表達(dá)水平最高;2.應(yīng)用FAM-siRNA轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞,在顯微鏡下可觀察到分布廣泛的熒光,轉(zhuǎn)染效率可達(dá)85%以上,說明siRNA成功轉(zhuǎn)入A2780細(xì)胞并取得良好的轉(zhuǎn)染效果;3.siRNA能夠有效地抑制HIF-1α基因的表達(dá),mRNA水平抑制率達(dá)到800%,蛋白水平抑制率達(dá)到60%以上;4.與常氧培養(yǎng)環(huán)境相比,缺氧環(huán)境培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞中MMP13在mRNA水平和蛋白水平均顯著增多,經(jīng)相關(guān)性分析,MMP13表達(dá)與HIF-1α呈正相關(guān),Pearson相關(guān)系數(shù)為0.8813;siRNA抑制HIF-1 α表達(dá)后,MMP13 mRNA水平及蛋白水平表達(dá)均明顯降低,;5.卵巢癌A2780細(xì)胞在缺氧環(huán)境下,與常氧組相比,侵襲穿膜的細(xì)胞數(shù)增加;經(jīng)siRNA沉默HIF-1α表達(dá)后,缺氧環(huán)境中的卵巢癌細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少;結(jié)論:低氧微環(huán)境使卵巢癌A2780細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)增多,HIF-1α可能通過上調(diào)MMP13表達(dá)增強(qiáng)缺氧環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。研究目的:樹突狀細(xì)胞是迄今發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞。DC誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答具有獨(dú)特的功能,能夠攝取加工提呈抗原,表達(dá)高水平的MHCⅠ和MHCⅡ類分子、多種共刺激分子和黏附分子等,啟動T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。腫瘤DC疫苗可將外源性腫瘤抗原、免疫輔助因子導(dǎo)入DC,增強(qiáng)其提呈能為,從而產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,完成對惡性腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。目前DC疫苗在腫瘤治療中的應(yīng)用己成為肺瘤免疫治療的熱點(diǎn)之一。盡管DC疫苗的研制和開發(fā)已經(jīng)歷數(shù)十年的發(fā)展,許多體外實(shí)驗(yàn)己經(jīng)證實(shí)了DC疫苗具有很好的抗腫瘤效應(yīng),但是動物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)并未取得預(yù)期的效果,不能抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,真正應(yīng)用到臨床實(shí)踐的DC疫苗甚少,究其原因可能是DC在機(jī)體腫瘤微環(huán)境下發(fā)生了免疫耐受。了解腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境對DC的作用及其機(jī)制,進(jìn)一步揭示腫瘤免疫耐受的機(jī)制,將有助于改進(jìn)DC腳瘤免疫治療的方法。研究方法:1.培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,收集腫瘤上清:腫瘤細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng),以l×10~6/ml的細(xì)胞濃度種于培養(yǎng)瓶中,24h后收集上清,凍存于-20℃冰箱中備用;DC培養(yǎng)基含50%腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清模擬腫瘤微環(huán)境,不含有腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的DC培養(yǎng)基設(shè)為對照;2.小鼠骨髓來源DC的培養(yǎng),顯微鏡觀察DC形態(tài):無菌分離小鼠股骨和腔骨,用RPMI1640培養(yǎng)基沖洗骨髓,獲得骨髓細(xì)胞,去除紅細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度為l×10~6/ml,骨髓細(xì)胞在含GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后去除未貼壁細(xì)胞,更換含有GM-CSF和比-4的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4天,第6天添加LPS促進(jìn)DC成熟,48h后收集懸浮細(xì)胞;3.流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子表達(dá)情況:收集成熟DC于流式管,用PBS洗滌后,加入熒光標(biāo)記的CD80、CD86、MHCⅡ抗體臘育30min,上機(jī)檢測;4.基因總片檢測差異表達(dá)基因:收集兩組DC,常規(guī)提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,與基固芯片雜交,經(jīng)數(shù)據(jù)分析,獲得兩組細(xì)胞間差異表達(dá)的基因;5.驗(yàn)證差異表達(dá)基因的結(jié)果:采用RT-PCR對基因芯片檢測結(jié)果在mRNA水平進(jìn)行驗(yàn)證;Western blot法在蛋白水平檢測其表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4的培養(yǎng),LPS刺激成熟后逐漸向DC分化,顯微鏡下成熟DC為懸浮生長,樹突狀結(jié)構(gòu)明顯;經(jīng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清處理過的DC形態(tài)與對照組相比無明顯差別;2.收集成熟DC進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測,與對照組相比,經(jīng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清處理過的DC表面分子CD80、CD86、MHCⅡ表達(dá)均明顯下調(diào);3.收集兩組DC提取總RNA,進(jìn)行基因芯片檢測,得到差異表達(dá)的基因;4.RT-PCR法驗(yàn)證差異表達(dá)的基因,與對照組相比,經(jīng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清處理過的DC,TRAF6在mRNA水平表達(dá)下調(diào);Western blot檢測顯示在蛋白水平,TRAF6表達(dá)也是下調(diào)的;結(jié)論:DC成熟過程在腫瘤微環(huán)境中受到抑制可能是腫瘤免疫耐受的重要原因,而導(dǎo)致DC成熟障礙的可能機(jī)制是腫瘤微環(huán)境抑制了TRAF6在DC中的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

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7 趙U，

本文編號：1561649