本文選題：NEDD9　切入點(diǎn)：上皮性卵巢癌　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，其死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤之首，其中，上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）是卵巢癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，約占所有卵巢癌的80%以上。因?yàn)槁殉采畈赜谂枨�，早期發(fā)生病變時(shí)，患者往往無(wú)癥狀，且由于缺乏早期診斷卵巢癌的有效方法，導(dǎo)致70-75%的患者就診時(shí)已屬晚期，已出現(xiàn)了廣泛的盆腹腔擴(kuò)散或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。盡管理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案對(duì)卵巢癌患者有效，但治療效果差，復(fù)發(fā)率高，且易產(chǎn)生化療藥物耐藥，迄今為止，卵巢癌患者的5年生存率仍徘徊在30%左右。卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥是臨床治療卵巢癌的難點(diǎn)。因此，尋找高敏感性和特異性的生物學(xué)標(biāo)記物對(duì)于闡述調(diào)控卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制具有十分重要的價(jià)值。 NEDD9(Neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated9)屬于接頭分子CAS家族中的一員，是一種骨架蛋白，定位于黏著斑，它在介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合體調(diào)控細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲、趨化作用、凋亡/失巢凋亡和細(xì)胞周期等諸多生物學(xué)行為�，F(xiàn)有證據(jù)表明，NEDD9是惡性腫瘤的促轉(zhuǎn)移基因，其高表達(dá)與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，如黑色素瘤、乳腺癌和頭頸部鱗癌等。已有國(guó)外研究小組通過(guò)基因芯片篩選出NEDD9是晚期漿液性卵巢癌與早期漿液性卵巢癌差異表達(dá)的基因，但未進(jìn)一步驗(yàn)證。NEDD9蛋白在卵巢癌中的表達(dá)及作用目前尚無(wú)從得知。因此，本課題將通過(guò)以下三部分的研究初步探討NEDD9在EOC中的表達(dá)和臨床意義，及其在EOC惡性生物學(xué)行為中的作用及機(jī)制，以期為早期診斷和基因靶向治療EOC提供新的靶點(diǎn)。 第一部分 NEDD9在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義 目的：檢測(cè)NEDD9在EOC組織和細(xì)胞中的表達(dá)，并分析NEDD9的表達(dá)水平與EOC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。 方法： （1）采用免疫組化法檢測(cè)NEDD9蛋白在129例EOC、18例卵巢交界性囊腺瘤、22例卵巢良性囊腺瘤及15例正常卵巢組織石蠟標(biāo)本中的表達(dá)，并分析NEDD9蛋白表達(dá)水平與EOC患者臨床病理特征的相關(guān)性。 （2）采用Western blotting法檢測(cè)NEDD9蛋白在28例EOC、10例卵巢交界性囊腺瘤、14例卵巢良性囊腺瘤及10例正常卵巢組織新鮮冰凍標(biāo)本中的表達(dá)。 （3）采用Kaplan-Meier法分析NEDD9蛋白表達(dá)水平對(duì)EOC患者生存時(shí)間的影響，并采用COX回歸分析探討影響EOC患者生存時(shí)間的因素。 （4）采用Western blotting檢測(cè)NEDD9蛋白在不同EOC細(xì)胞株（SKOV3、OVCAR-3、3AO、A2780）中的表達(dá)，并采用免疫熒光法分析NEDD9蛋白在EOC細(xì)胞中的定位。 結(jié)果： （1）免疫組化結(jié)果顯示，NEDD9在129例EOC組織中廣泛表達(dá)（高表達(dá)：69.0%，低表達(dá)：31.0%）；而在正常卵巢組織、卵巢良性囊腺瘤組織及卵巢交界性囊腺瘤組織中表達(dá)很低甚至不表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率依次為：6.7%，13.6%，16.7%，與EOC相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。在EOC組織中，NEDD9蛋白在FIGO III/IV期組織中的表達(dá)高于在FIGOⅠ/Ⅱ期組織中的表達(dá)（P＜0.001）、在中低分化腫瘤組織（G2/G3級(jí)）中的表達(dá)高于在高分化腫瘤組織（G1級(jí)）中的表達(dá)（P＜0.001）、在術(shù)后殘余腫瘤直徑≥1cm組織中的表達(dá)高于在術(shù)后殘余腫瘤直徑＜1cm組織中的表達(dá)（P=0.028），但其表達(dá)水平與EOC患者診斷時(shí)的年齡，血清CA125水平，腹水量及病理類(lèi)型無(wú)關(guān)（P＞0.05）。 （2）Western blotting結(jié)果顯示，NEDD9蛋白在EOC組織中的表達(dá)（1.46±0.26）明顯高于其在正常卵巢（0.52±0.06；P＜0.01）、卵巢良性囊腺瘤（0.52±0.11；P＜0.01）和卵巢交界性囊腺瘤（0.68±0.12；P＜0.01）組織中的表達(dá)。 （3）Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示， NEDD9蛋白高表達(dá)的EOC患者的總生存期/疾病無(wú)進(jìn)展生存期明顯短于NEDD9蛋白低表達(dá)的EOC患者（P＜0.001），多因素COX回歸分析表明：NEDD9蛋白高表達(dá)（HR=2.006，P=0.033）、FIGO分期晚（HR=8.786，P＜0.001）、腫瘤組織分化差（HR=11.210，P=0.01）仍是EOC的獨(dú)立預(yù)后因子。 （4）NEDD9在SKOV3，OVCAR-3和3AO三種細(xì)胞株中表達(dá)較高，而在A2780細(xì)胞中表達(dá)較低。免疫熒光結(jié)果顯示，NEDD9蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞的胞漿及胞膜。 結(jié)論：NEDD9蛋白在EOC組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與EOC患者的FIGO分期晚、腫瘤組織病理分化差、不理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示NEDD9可能在調(diào)控EOC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。NEDD9在EOC細(xì)胞株中的表達(dá)不同，可能與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。 第二部分 NEDD9shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞的篩選 目的：構(gòu)建靶向沉默NEDD9基因的慢病毒載體，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NEDD9shRNA慢病毒的SKOV3細(xì)胞株，為進(jìn)一步的細(xì)胞功能學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 方法： （1）設(shè)計(jì)并合成四條靶向沉默NEDD9shRNA序列（NEDD9shRNA-1，-2，-3，4）和一條陰性對(duì)照序列，連接入線性化的慢病毒載體，PCR篩選陽(yáng)性克隆，，DNA對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。 （2）將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒與Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，收獲上清并濃縮、測(cè)定滴度。 （3）按MOI=40轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72h后收獲細(xì)胞，采用Real-time PCR法檢測(cè)NEDD9mRNA的表達(dá)，初步篩選干擾效果最佳的靶點(diǎn)。 （4）利用干擾效果最佳的靶點(diǎn)慢病毒建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞，并采用Real-time PCR和Western blotting分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后SKOV3細(xì)胞中NEDD9mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： （1）設(shè)計(jì)并成功合成四條NEDD9shRNA干擾序列和一條陰性對(duì)照序列。DNA測(cè)序鑒定表明成功構(gòu)建了NEDD9shRNA慢病毒重組質(zhì)粒。 （2）慢病毒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞72h后的PCR結(jié)果顯示，NEDD9sh RNA-4靶點(diǎn)干擾效果最佳。 （3）利用嘌呤霉素成功篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NEDD9shRNA-4慢病毒載體的SKOV3細(xì)胞株，并且Real-time PCR和Westernblotting分析結(jié)果顯示NEDD9mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯被抑制。 結(jié)論：成功構(gòu)建并篩選出高效靶向干擾NEDD9基因的慢病毒表達(dá)載體（NEDD9shRNA-4），并成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的卵巢癌 SKOV3細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究NEDD9調(diào)控卵巢癌SKOV3細(xì)胞惡性行為的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 第三部分 NEDD9shRNA對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制初步探討 目的：觀察NEDD9基因沉默對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞惡性行為的影響，初步探討NEDD9參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。 方法：將NEDD9基因沉默前后的SKOV3細(xì)胞分為三組，即未轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞為SKOV3-CON組；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列的SKOV3細(xì)胞為SKOV3-NC組；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染沉默NEDD9基因的SKOV3細(xì)胞為SKOV3-KD組。 （1）采用粘附實(shí)驗(yàn)觀察NEDD9基因沉默前后SKOV3細(xì)胞粘附能力的變化。 （2）采用Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察NEDD9基因沉默前后SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。 （3）采用MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察基因沉默前后SKOV3細(xì)胞克隆增殖能力的變化。 （4）采用Western blotting法檢測(cè)NEDD9基因沉默前后SKOV3細(xì)胞中E-cadherin、MMPs及ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： （1）粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NEDD9基因沉默使SKOV3細(xì)胞的同質(zhì)粘附能力增強(qiáng)，異質(zhì)粘附能力減弱。 （2）NEDD9基因沉默抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SKOV3-CON組和SKOV3-NC組相比，SKOV3-KD組的穿過(guò)聚碳酸脂膜的遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SKOV3-CON組和SKOV3-NC組相比，SKOV3-KD組穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。 （3）NEDD9基因沉默降低卵巢癌SKOV3細(xì)胞的體外增殖能力：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察培養(yǎng)0-7d后，與SKOV3-CON組和SKOV3-NC組相比，SKOV3-KD組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線相對(duì)平緩，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖明顯收到抑制（P＜0.05）平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SKOV3-CON組和SKOV3-NC組相比，SKOV3-KD組細(xì)胞的克隆形成數(shù)目明顯減少（P＜0.05）。 （4）Western blotting結(jié)果顯示，NEDD9基因沉默后，SKOV3細(xì)胞中E-caherin表達(dá)增加，MT1-MMP、MMP-2和P-ERK1/2表達(dá)減少，而MMP-9和p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)則無(wú)變化。 結(jié)論：NEDD9基因沉默增強(qiáng)了卵巢癌SKOV3細(xì)胞的同質(zhì)粘附能力，降低了異質(zhì)粘附能力，抑制了細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力；NEDD9可能通過(guò)調(diào)控ERK1/2信號(hào)通路的活性介導(dǎo)EOC的惡性生物學(xué)行為。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 周坤;王耕;潘俊峰;葛明建;;Lumican基因過(guò)表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制探討[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2013年09期

本文編號(hào)：1558883