本文選題：卵巢透明細(xì)胞腫瘤　切入點(diǎn)：ES2細(xì)胞系　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一,其中上皮性卵巢癌占原發(fā)性卵巢腫瘤50%～70%,目前認(rèn)為上皮來源的卵巢癌是由一組不同形態(tài)及不同分子遺傳特性的獨(dú)立疾病所構(gòu)成的一類腫瘤。透明細(xì)胞瘤是上皮性卵巢腫瘤中的一種,在東方女性中較西方更為常見。和其它類型的上皮性卵巢癌相比,透明細(xì)胞瘤大部分為惡性腫瘤,預(yù)后不佳,并且對(duì)化療不敏感。故此,將卵巢透明細(xì)胞腫瘤當(dāng)做一類獨(dú)立腫瘤進(jìn)行相關(guān)研究具有必要性。EPA(二十碳五烯酸)屬于n-3多元不飽和脂肪酸,雖然人體內(nèi)可以通過亞麻酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)少量的EPA,但是人體所需EPA大部分仍然從食物中獲取。一些學(xué)者對(duì)比了某些種類癌癥患者和正常人血漿中的EPA的含量,發(fā)現(xiàn)前者血漿中EPA的含量明顯低于正常人血漿,這一臨床現(xiàn)象提示了EPA對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著某些作用。目前,在癌癥惡病質(zhì)患者中,攝入EPA可以維持和增加惡病質(zhì)患者的體重,并且也能增加化療敏感性。卵巢透明細(xì)胞癌由于其惡性程度高和對(duì)化療不敏感,由此我們思考EPA是否也能影響卵巢透明細(xì)胞癌,目前在所有EPA和腫瘤的研究中,還沒有研究證實(shí)過EPA和卵巢透明細(xì)胞癌的關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)研究中,通過對(duì)卵巢透明細(xì)胞系ES2的研究,證實(shí)了EPA可以有效抑制ES2的增殖,促進(jìn)其凋亡。進(jìn)而,本實(shí)驗(yàn)尋求了EPA影響卵巢透明細(xì)胞癌的相關(guān)機(jī)制。在近年研究中,脂肪酸可通過一系列的G蛋白偶聯(lián)受體實(shí)現(xiàn)其各種生物學(xué)效應(yīng),包括對(duì)細(xì)胞膜的形成、膜受體的組成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因轉(zhuǎn)錄和炎癥等方面,這一類G蛋白偶聯(lián)受體也被稱為脂肪酸受體(free fatty acid receptor, FFAR)。不同的FFAR對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸的識(shí)別具有特異,例如FFAR1(GPR40)和GPR120是目前己報(bào)道的可以識(shí)別長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的FFAR,它們的Gα亞基均為Gaq/11。我們首先猜測(cè)GPR40和GPR120是否在ES2細(xì)胞中介導(dǎo)EPA的生物學(xué)效應(yīng),但實(shí)驗(yàn)證實(shí)ES2中GPR120和GPR40的表達(dá)量非常低,并且無法檢測(cè)到Gα亞基激活后可引起的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度上升。所以,我們探尋是否存在其它的G蛋白偶聯(lián)受體可以在ES2細(xì)胞中介導(dǎo)EPA作用。GPR30是近年報(bào)道的一種新的雌激素受體,主要介導(dǎo)雌激素的快速非基因組效應(yīng),其α亞基為Gs,主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。GPR30和傳統(tǒng)雌激素受體ERa、β沒有同源性,但是其配體種類大致相同。其對(duì)17βE2產(chǎn)生3-6nM親和力,但對(duì)17αE2、雌酮和雌三醇的親和力非常低,而對(duì)孕酮、皮質(zhì)醇和睪酮幾乎沒有結(jié)合力。此外,些合成的抗雌激素藥物中,例如他莫昔芬和氟維司群(ICI182780),以及一些植物類雌激素,例如大豆,也均為GPR30的配體。當(dāng)GPR30的配合和其結(jié)合之后,偶聯(lián)的G蛋白被激活,分離為Gα和Gβγ異二聚體。Gβγ異二聚體可以激活Src和AC,前者可以通過一些列反應(yīng)激活細(xì)胞膜上得EGFR受體,后者可以引起細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度上升,從而產(chǎn)生下游生物學(xué)效應(yīng)。關(guān)于GPR30在組織學(xué)中的表達(dá),其可在正常的乳腺、卵巢、子宮等組織中表達(dá),也可在一些病理組織中表達(dá),例如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、甲狀腺癌、前列腺癌和肺癌。其中,在卵巢癌中,GPR30的表達(dá)量和其預(yù)后相關(guān)。目前,關(guān)于GPR30所能引起的分子生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制的研究仍然很欠缺,在本文中,首次證明了EPA可以作為GPR30的配體,并且在ES2細(xì)胞中,EPA通過GPR30產(chǎn)生其各項(xiàng)生物學(xué)效應(yīng)。第一部分EPA在體外影響卵巢透明細(xì)胞癌生長(zhǎng)目的在體外條件下,從細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡兩方面,進(jìn)行EPA對(duì)卵巢透明癌細(xì)胞系ES2影響的評(píng)估。方法在不同濃度(0-300uM)不同種類(棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、亞麻酸、二十碳五烯酸)的脂肪酸處理下,使用CellTiter 96(?) Aqueous Non-Radioactive試劑盒測(cè)試ES2細(xì)胞增殖；為排除脂肪酸對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生脂毒性而抑制細(xì)胞生長(zhǎng),使用CCK-8細(xì)胞毒性測(cè)試對(duì)不同濃度不同種類脂肪酸加入ES2后進(jìn)行檢測(cè),選擇本實(shí)驗(yàn)所用的脂肪酸實(shí)驗(yàn)濃度；在實(shí)驗(yàn)濃度下,不同脂肪酸在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)ES2細(xì)胞增殖的影響；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入EPA后ES2細(xì)胞凋亡的改變；使用RT-PCR檢測(cè)加入EPA后ES2中促凋亡基因(bax、bim、puma)及抑凋亡基因(bcl-2, bcl-xl, survivin)的mRNA含量改變。結(jié)果EPA在300uM的濃度下不會(huì)對(duì)ES2細(xì)胞產(chǎn)生脂毒性。EPA對(duì)ES2細(xì)胞增殖具有劑量效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)；EPA可以促進(jìn)ES2細(xì)胞凋亡,并且促進(jìn)促凋亡基因表達(dá)(bax、bim、puma),降低抑凋亡基因表達(dá)(bcl-2, bcl-xl, survivin)結(jié)論EPA在體外可以影響卵巢透明細(xì)胞癌的生長(zhǎng),具體表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。第二部分EPA通過GPR30影響卵巢透明細(xì)胞癌生長(zhǎng)目的探求ES2中介導(dǎo)EPA主要生物學(xué)功能的受體。方法在加入Gq抑制劑Ym25486或不加的條件下,驗(yàn)證EPA和PAL已發(fā)現(xiàn)的受體GPR40和GPR120的下游效應(yīng),即細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升。此外,加入Ym25486后檢測(cè)EPA對(duì)ES2的抑制增殖和促進(jìn)凋亡效應(yīng)是否有改變。使用RT-PCR檢測(cè)己報(bào)道的各類脂肪酸受體和GPR30在ES2中的mRNA表達(dá)。利用脂肪酸-蛋白結(jié)合試驗(yàn)確定在ES2細(xì)胞中EPA是否可以直接結(jié)合于GPR30。通過siRNA和加入GPR30抑制劑G15的方法,探求GPR30是否為ES2中主要介導(dǎo)EPA作用的受體。通過western blot、cAMP濃度檢測(cè)、RT-PCR方法驗(yàn)證EPA激活GPR30后的下游途徑。結(jié)果未加入Ym25486時(shí),EPA引起ES2中1.5倍的鈣離子濃度改變,作為對(duì)比,PAL引起ES2中4倍的鈣離子濃度改變。加入Ym25486后,EPA引起的ES2中鈣離子濃度變化不因Ym25486而改變,作為對(duì)比,PAL引起的ES2中鈣離子濃度上升收到Y(jié)m25486的抑制。相應(yīng)地,Ym25486不影響EPA對(duì)ES2產(chǎn)生的抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。GPR30在ES2中的表達(dá)量比其余已報(bào)道的脂肪酸受體明顯高。并且在ES2細(xì)胞中,EPA可以直接識(shí)別GPR30。通過siRNA干擾GPR30表達(dá)或者加入GPR30抑制劑G15后,EPA對(duì)ES2產(chǎn)生的抑制增殖和促進(jìn)凋亡效應(yīng)均有明顯恢復(fù)。EPA可以通過GPR30引起ES2中ERK和Akt磷酸化水平下降,并且引起cAMP濃度上升進(jìn)而活化蛋白激酶A。結(jié)論已發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈脂肪酸受體GPR40和GPR120不是介導(dǎo)EPA在ES2中產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的受體。GPR30可以作為EPA的受體,并且介導(dǎo)EPA在ES2中抑制增殖和促進(jìn)凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。第三部分EPA在體內(nèi)通過GPR30影響卵巢透明細(xì)胞癌生長(zhǎng)目的驗(yàn)證在體內(nèi),EPA是否通過GPR30影響卵巢透明細(xì)胞癌ES2的生長(zhǎng)。方法使用BALC/c雌性裸鼠構(gòu)建ES2細(xì)胞皮下瘤模型。于裸鼠右側(cè)腋部皮下2*106/200ul/只接種,每日觀察裸鼠成瘤情況。將成瘤小鼠隨機(jī)分為四組,NC組、NC+EPA組、shRNA組口shRNA+EPA組,其中shRNA組和shRNA+EPA組小鼠的皮下瘤通過shRNA干擾了ES2中GPR30表達(dá)。第五日開始進(jìn)行EPA瘤周注射處理,NC+EPA組和siGPR30+EPA組中,每隔2日給予EPA 300uM 200ul局部瘤周皮下注射。于第14日解剖皮下瘤,測(cè)量腫瘤體積及重量,并進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。結(jié)果第4日皮下可見類圓形腫塊,直徑約5mm。加入EPA處理后,裸鼠所荷腫瘤明顯縮小。對(duì)比shRNA組和shRNA+EPA組,在干擾了GPR30表達(dá)之后,加入EPA后腫瘤大小沒有明顯變化。免疫組化結(jié)果提示,EPA不影響GPR30的表達(dá),但加入EPA后,Ki67表達(dá)明顯下降。干擾GPR30表達(dá)后,加入EPA并不引起Ki67表達(dá)改變。結(jié)論EPA可以在體內(nèi)影響荷ES2細(xì)胞腫瘤的生長(zhǎng)。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：1558577