本文關鍵詞： 過度自噬 早發(fā)型子癇前期 滋養(yǎng)細胞 血管內皮細胞 胎盤功能紊亂　出處：《重慶醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：本文通過檢測人胎盤滋養(yǎng)細胞和血管內皮細胞中自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1light chain3，LC3）和Beclin-1的表達情況，證實早發(fā)型子癇前期胎盤中滋養(yǎng)細胞和血管內皮細胞發(fā)生過度自噬。進而，通過葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase, GO）模擬體外氧化應激環(huán)境，以滋養(yǎng)細胞和血管內皮細胞為研究對象，探討過度自噬參與早發(fā)型子癇前期（early-onsetpreeclampsia，EOPE）胎盤功能紊亂的病理及分子機制。 方法：1.收集2010年1月至2012年5月在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產科收治的18例早發(fā)型子癇前期（34孕周）患者的胎盤組織和同期住院分娩的20例正常產婦的胎盤組織。應用免疫組化檢測各組胎盤組織中滋養(yǎng)細胞和血管內皮細胞LC3和Beclin-1的表達；透射電鏡觀察兩組胎盤組織中滋養(yǎng)細胞和血管內皮細胞自噬體的發(fā)生情況；組織免疫熒光共標法檢測硝基酪氨酸（nitrotyrosine）和LC3、Beclin-1在胎盤組織中的表達關系。2.以GO模擬氧化應激環(huán)境，通過細胞免疫熒光法、實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）及蛋白印記法（western blot, WB）方法測定經處理后的人絨毛外滋養(yǎng)細胞株（HTR8/SVneo）和人臍靜脈內皮細胞株（humanumbilical vein endothelial cells, HUVECs）自噬發(fā)生的情況，透射電鏡觀察各組細胞中自噬體。然后通過hoechst33258觀察各組細胞凋亡發(fā)生情況，WB檢測各組細胞中cleaved caspase-3的表達情況。最后通過WB檢測滋養(yǎng)細胞中基質金屬蛋酶9（matrix metalloproteinase9,MMP9）和血管內皮細胞中血管內皮生長因子受體2（vascularendothelial growth factors receptor2, VEGFR2）表達情況，transwell侵襲實驗檢測滋養(yǎng)細胞細胞侵襲能力，管腔成形實驗檢測HUVECs的成管能力。 結果：1. EOPE胎盤中自噬發(fā)生增加。（1）免疫組化提示早發(fā)型子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞和血管內皮細胞中LC3和Beclin-1表達量較正常胎盤增高（P 0.05）。（2）透射電鏡在早發(fā)型子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞和血管內皮細胞中均找到典型的自噬體。（3）組織免疫熒光共標法發(fā)現(xiàn)EOPE胎盤中nitrotyrosine表達較正常胎盤增加，同時EOPE胎盤中LC3和Beclin-1表達增強。2.氧化應激誘導的過度自噬削弱HTR8/SVneo和HUVECs細胞功能。（1）細胞免疫熒光、qRT-PCR、WB均提示GO模擬氧化應激環(huán)境下HTR8/SVneo和HUVECs中GO組LC3和Beclin-1表達較正常組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P 0.05）；同時通過透射電鏡在HTR8/SVneo和HUVECs GO組中找到典型自噬體。（2）Hoechst33258染色提示各組細胞中凋亡的發(fā)生無明顯差異，同時WB提示各組細胞中cleaved caspase-3表達無明顯差異（P0.05）。（3）WB及細胞免疫熒光結果示HTR8/SVneo中GO組MMP9表達較其他組降低（P 0.05）；transwell侵襲實驗結果示GO組HTR8/SVneo細胞侵襲力較其他組明顯降低（P 0.05），3-MA+GO組細胞侵襲力較GO組增加（P 0.05）。HUVECs中，WB和細胞免疫熒光結果示GO組VEGFR2的表達較其他組降低（P 0.05），，3-MA+GO組VEGFR2表達較GO組增加（P 0.05）。管腔成形驗結果示GO組HUVEC細胞成管能力較其他組降低（P 0.05)，3-MA+GO組細胞成管能力較GO組增加（P 0.05）。 結論：1.早發(fā)型子癇前期胎盤中發(fā)生過度自噬。2.過度自噬降低HTR8/SVneo侵襲力和HUVECs管腔成形能力。3.滋養(yǎng)細胞和血管內皮細胞過度自噬可能是早發(fā)型子癇前期胎盤功能紊亂的另一重要發(fā)病機制。
[Abstract]:Objective: through the detection of autophagy of human placental trophoblast cells and vascular endothelial cells in protein microtubule associated protein 1 light chain 3 (microtubule-associated protein1light, chain3, LC3 and Beclin-1) expression, confirmed early onset preeclampsia placental trophoblast cells and vascular endothelial cells to excessive autophagy. Furthermore, the glucose oxidase (glucoseoxidase, GO simulation in vitro oxidative stress environment), to nourish cells and vascular endothelial cells as the research object, investigate the excessive autophagy in early onset preeclampsia (early-onsetpreeclampsia, EOPE) pathology and molecular mechanism of placental dysfunction.
Methods: 1. from January 2010 to May 2012 in First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University from 18 cases of early-onset preeclampsia (34 weeks) placenta tissue and 20 cases of normal pregnancy placenta of patients and the same period of delivery in hospital. The expression of immunohistochemistry was detected in the placental tissue of trophoblast cells and vascular endothelial cells LC3 and Beclin-1 were observed; two groups of placenta trophoblast and endothelial cells autophagy of TEM; immunofluorescence is standard method for the detection of nitrotyrosine (nitrotyrosine) and LC3,.2. was simulated by GO under oxidative stress and the expression of Beclin-1 in placenta tissues, cells by immunofluorescence, real-time fluorescence quantitative PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR) and Western blot (Western blot WB) method for the determination of the treated human extravillous trophoblast fine Cell line (HTR8/SVneo) and human umbilical vein endothelial cell line (humanumbilical vein endothelial cells, HUVECs) of autophagy, autophagy in the cells were observed by transmission electron microscope. Then through the body to observe the occurrence of apoptosis of hoechst33258 cells, the expression of WB was detected by cleaved caspase-3. Finally by trophoblast cells detection in WB metal matrix 9 eggs (matrix Metalloproteinase9, MMP9 enzyme) in vascular endothelial cells and vascular endothelial growth factor receptor 2 (vascularendothelial growth factors receptor2, VEGFR2) expression of Transwell and invasion capability of cell assay nourish, lumen into the tube forming experiment of HUVECs detection ability.
Results: 1. EOPE increased autophagy in the placenta. (1) immunohistochemistry showed early onset preeclampsia placental trophoblast cells and vascular endothelial cells LC3 and Beclin-1 expression of zfyve26in normal placenta (P 0.05). (2) transmission electron microscope were found in typical autophagosomes in early onset preeclampsia placental trophoblast cells and blood vessels endothelial cells. (3) immunofluorescence were found to increase the standard method than the normal placental nitrotyrosine expression of EOPE in placenta, EOPE and LC3 in placenta and the increased expression of Beclin-1 excessive autophagy in.2. induced oxidative stress and weaken the HTR8/SVneo HUVECs cell function. (1) immunofluorescence, qRT-PCR, WB showed that compared with normal GO simulation group LC3 and group GO increased the expression of Beclin-1 under oxidative stress of HTR8/SVneo and HUVECs, the difference was statistically significant (P 0.05); at the same time through transmission electron microscopy to find the typical autophagosomes in HTR8/SVneo and HUVECs (2 in the GO group. Hoechst33258 staining) prompt cell apoptosis was no significant difference in WB at the same time, suggesting that these cells cleaved caspase-3 expression had no significant difference (P0.05). (3) WB and cell immunofluorescence showed that HTR8/SVneo GO expression of MMP9 was lower than other groups (P 0.05); Transwell invasion experiment results show the GO group of HTR8/SVneo cells the invasion was significantly lower than the other groups (P 0.05), 3-MA+GO group of cell invasion were higher than that in GO group (P 0.05).HUVECs, WB expression and cell immunofluorescence showed that GO group VEGFR2 lower than other groups (P 0.05), 3-MA+GO group increased VEGFR2 expression compared with GO group (P 0.05). Lumen forming the results showed HUVEC cells GO group forming lower than other groups (P 0.05), 3-MA+GO group cell tube formation were higher than that in GO group (P 0.05).
Conclusion: excessive autophagy decreased HTR8/SVneo invasion and HUVECs lumen forming ability of.3. in trophoblast cells and vascular endothelial cells may be excessive autophagy in early onset preeclampsia placenta dysfunction is another important pathogenesis of excessive autophagy in.2. occurred in 1. early onset preeclampsia.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R714.255

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本文編號：1554099