本文關鍵詞： 卵巢癌 KIAA1529 有絲分裂 紫杉醇 耐藥 GSK-3β Aurora B　出處：《華中科技大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景與目的 卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,也是婦科腫瘤惡性程度最高的疾病。據統(tǒng)計,每年出現約22200個卵巢癌新診斷病例,同時超過約15000位卵巢癌患者出現死亡。卵巢癌的早期癥狀較為隱匿。當發(fā)現診斷該疾病時,患者的病情已多發(fā)展為中晚期。目前卵巢癌的治療標準仍為手術治療后輔助以鉑類聯合紫杉醇的化療方案。但大部分患者最終出現對常規(guī)化療藥物耐藥,從而限制了化療藥物的治療效果。所以在過去的幾十年中,卵巢癌的5年生存率仍徘徊在40%左右,并未出現明顯的改善。在臨床的治療過程中,卵巢癌患者的預后很大程度上取決于患者對治療的反應性,化療方案的制定需根據患者的病情、手術經過、病理診斷等多因素進行綜合評估。而實行個體化的治療方案是目前國內外婦科腫瘤醫(yī)師主要的研究目標及方向。 紫杉醇作為卵巢癌治療的一線化療藥物,其主要的抗腫瘤作用為誘導并促進腫瘤細胞的微管聚合,產生穩(wěn)定的微管結構,阻止有絲分裂過程中細胞染色體的正常排列及分離,從而抑制細胞周期的進展,最終導致腫瘤細胞凋亡。一般認為,紫杉醇發(fā)揮抗腫瘤效應的重要機制是促進腫瘤細胞微管聚合,抑制腫瘤細胞微管解聚,使細胞分裂阻滯于G2/M期。 在本實驗室的前期研究中,通過RNAi文庫技術與蛋白質免疫共沉淀,質譜分析等蛋白質組學的研究方式相結合,在AKT/GSK-3β信號通路中發(fā)現一個新基因KIAA1529可能參與了卵巢癌的紫杉醇耐藥。本研究旨在探討KIAA1529編碼蛋白KA在多種腫瘤細胞系中的表達,并通過藥物干預及RNA干擾技術探討KA在GSK-3β信號通路中卵巢癌對紫杉醇耐藥的作用及相關機制,為逆轉卵巢癌治療過程中出現的紫杉醇耐藥提供一個可能的新的分子治療靶點。 方法 收集本實驗室相關腫瘤細胞系,用TRIzol法提取各腫瘤細胞系的總RNA,采用熒光實時定量PCR方法檢測肺癌細胞系、乳腺癌細胞系及卵巢癌細胞系中KIAA1529基因mRNA水平的表達,用蛋白質印跡法檢測卵巢癌細胞系中KIAA1529基因編碼蛋白KA的表達。 使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl通過磷酸化抑制GSK-3β,同時在紫杉醇的作用下,采用蛋白質印跡法檢測不同處理組卵巢癌SKOV3細胞中GSK-3β、 p-GSK-3β、KA的蛋白表達變化。用流式細胞儀檢測各組細胞周期的變化及各組細胞有絲分裂指數的改變。采用對SKOV3細胞中的p-H3及α-tubulin進行免疫熒光染色,觀察各組細胞中進行有絲分裂細胞比例的變化及細胞骨架形態(tài)的改變。用流式細胞儀檢測各組理組細胞的凋亡情況。 采用RNA干擾技術,將KA siRNA轉染至卵巢癌SKOV3細胞,熒光實時定量PCR法和蛋白質印跡法檢測轉染KA siRNA后對SKOV3細胞中KA表達的抑制效果。通過流式細胞儀檢測在使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,在紫杉醇作用下對照組與轉染組細胞周期及細胞有絲分裂指數的變化。采用對對照組及轉染組SKOV3細胞中p-H3及α-tubulin的熒光染色,觀察兩組間細胞有絲分裂細胞比例的變化及細胞骨架形態(tài)的改變。用流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡情況。 使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,在紫杉醇作用下,通過蛋白質印跡法檢測卵巢癌SKOV3細胞中有絲分裂紡錘體檢測點相關蛋白的表達變化。采用RNA干擾技術,將KA siRNA轉染卵巢癌SKOV3細胞,用蛋白質印跡法檢測在使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,紫杉醇作用下,對照組及轉染組有絲分裂紡錘體檢測點相關蛋白的表達變化。 采用RNA干擾技術,將Aurora B siRNA轉染至SKOV3細胞,用蛋白質印跡法檢測轉染Aurora B siRNA后,對SKOV3細胞中Aurora B蛋白表達的抑制效果。通過流式細胞儀檢測對照組與轉染組細胞有絲分裂指數的變化。采用對p-H3及a-tubulin的熒光染色,觀察對照組與轉染組細胞有絲分裂比例的變化及細胞骨架形態(tài)的改變。用流式細胞儀檢測對照組及轉染組細胞凋亡情況。 結果 1.通過熒光實時定量PCR檢測,發(fā)現KIAA1529基因在肺癌,乳腺癌及卵巢癌細胞系中均有表達。通過蛋白質印跡法檢測,發(fā)現KIAA1529基因編碼蛋白KA在卵巢癌SKOV3、A2780、C13K及OV2008細胞系中均有表達。在卵巢病變組織中,良性病變組織中KA的表達高于惡性腫瘤組織,并且在惡性病變組中,低分化腫瘤組織中KA比高分化及中分化的腫瘤組織中表達明顯降低。 2.蛋白質印跡法檢測提示,GSK-3β特異性抑制劑LiCl能明顯增加p-GSK-3p蛋白的表達。同時LiCl及紫杉醇共同處理組,比單獨使用紫杉醇處理組KA蛋白的表達明顯升高。流式細胞儀檢測結果顯示,使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后能減弱紫杉醇對卵巢癌SKOV3細胞的G2/M期阻滯,同時有絲分裂指數降低。通過免疫熒光技術觀察,SKOV3細胞在LiCl與紫杉醇共同作用下,相對于單用紫杉醇處理,阻滯于有絲分裂狀態(tài)的細胞比例明顯減少；同時出現細胞分裂期濃縮核結構及圓形細胞骨架結構的細胞比例明顯減少。流式細胞儀檢測發(fā)現LiCl與紫杉醇共同作用組,凋亡率較單用紫杉醇處理組降低。兩組差異均有統(tǒng)計學意義。 3.熒光實時定量PCR及蛋白質印跡法結果顯示,轉染KA siRNA后,卵巢癌SKOV3細胞中KA的mRNA與蛋白的表達顯著下調,對KA表達的抑制效果明顯。通過流式細胞儀檢測,同樣在LiCl與紫杉醇的作用下,轉染組G2/M期阻滯較對照組明顯,同時有絲分裂指數升高。通過免疫熒光技術觀察,在LiCl與紫杉醇共同作用下,轉染組阻滯于有絲分裂狀態(tài)的細胞比例升高；通過對α-tubulin的熒光染色發(fā)現,相對于對照組,轉染組出現細胞分裂期濃縮核結構及圓形細胞骨架結構的細胞比例明顯升高。且流式細胞儀檢測,與對照組相比,轉染組細胞凋亡率明顯升高。組間差異均有明顯統(tǒng)計學意義。 4.使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,在紫杉醇作用下,蛋白質印跡法檢測有絲分裂紡錘體檢測點相關蛋白Aurora A、Aurora B、BUBR1、MAD2、CDC20,結果顯示使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,在紫杉醇作用下,MAD2及CDC20的表達無明顯變化,僅有Aurora A、Aurora B、BUBR1蛋白出現相應的表達變化。在LiCl與紫杉醇共同作用下,相對于單用紫杉醇,Aurora A、Aurora B、BUBR1蛋白的表達均下調。轉染KA siRNA后,在LiCl與紫杉醇的聯合作用下,轉染組與對照組相比,Aurora A與BUBR1蛋白的表達無明顯改變,而Aurora B蛋白表達在轉染組抑制KA表達后上調。 5.蛋白質印跡法結果顯示,轉染Aurora B siRNA后,卵巢癌SKOV3細胞中Aurora B蛋白的表達顯著下調,對Aurora B表達的抑制效果明顯。流式細胞儀檢測結果表明,單用紫杉醇處理后,相對于對照組,轉染組細胞有絲分裂指數下,降。免疫熒光染色結果顯示,與對照組相比較,轉染組處于有絲分裂狀態(tài)的細胞減少,同時轉染組出現細胞分裂期濃縮核結構及圓形細胞骨架結構的細胞比例明顯減少。經流式細胞儀檢測,相對于對照組,轉染組轉染Aurora B siRNA后,在紫杉醇的作用下,凋亡率下降。 結論 新基因KIAA1529編碼及其編碼蛋白KA在卵巢癌細胞系中均有不同程度的表達。在卵巢病變組織中發(fā)現的KA表達差異顯示,新基因KIAA1529編碼蛋白KA與卵巢癌的分化有密切關系。 在GSK-3β信號通路中,通過GSK-3β特異性抑制劑LiCl作用于卵巢癌SKOV3細胞,使細胞中的GSK-3β磷酸化從而達到抑制GSK-3β的效果。當細胞中的GSK-3β通過磷酸化被抑制后,在紫杉醇的作用下,SKOV3細胞中KA蛋白的表達升高,同時出現紫杉醇所誘導的卵巢癌SKOV3細胞G2/M期阻滯的效應減弱,使腫瘤細胞從紫杉醇所誘導的有絲分裂阻滯狀態(tài)中逃逸,最終紫杉醇誘導的卵巢癌腫瘤細胞凋亡減少,從而產生對紫杉醇的耐藥。 而當通過RNA干擾技術抑制KA蛋白的表達后,逆轉了上述通過LiCl磷酸化抑制GSK-3p產生的卵巢癌SKOV3細胞的紫杉醇耐藥現象。說明通過磷酸化抑制GSK-3β所出現的卵巢癌細胞對紫杉醇耐藥機制,可能是通過新基因編碼蛋白KA的表達升高產生的。 實驗進一步證實,GSK-3β通過LiCl磷酸化被抑制后,在紫杉醇的作用下KA表達升高的同時,抑制了染色體過客蛋白復合物之一Aurora B蛋白的表達；而當通過RNA干擾技術抑制KA蛋白的表達,Aurora B蛋白的表達恢復。說明了KA表達的升高抑制了染色體過客蛋白Aurora B的表達,破壞了有絲分裂紡錘體檢測點的功能,從而使細胞逃逸了紫杉醇誘導的有絲分裂阻滯,造成卵巢癌腫瘤細胞對紫杉醇的耐藥。 綜上所述,本實驗首次在卵巢癌細胞中對新基因KIAA1529編碼蛋白KA的功能進行了初步的闡述。說明在GSK-3β信號通路中,KA作為GSK-3β的下游調控因子之一,通過對染色體過客蛋白復合物關鍵蛋白Aurora B表達的調節(jié),參與了卵巢癌紫杉醇耐藥；同時通過KA,也將GSK-3β信號通路與有絲分裂紡錘體檢測點功能聯系起來。因此,新基因KIAA1529編碼的大分子蛋白KA可能成為逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥的新的分子治療靶點。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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