本文關(guān)鍵詞： 卵巢癌 KIAA1529 有絲分裂 紫杉醇 耐藥 GSK-3β Aurora B　出處：《華中科技大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景與目的 卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,也是婦科腫瘤惡性程度最高的疾病。據(jù)統(tǒng)計,每年出現(xiàn)約22200個卵巢癌新診斷病例,同時超過約15000位卵巢癌患者出現(xiàn)死亡。卵巢癌的早期癥狀較為隱匿。當發(fā)現(xiàn)診斷該疾病時,患者的病情已多發(fā)展為中晚期。目前卵巢癌的治療標準仍為手術(shù)治療后輔助以鉑類聯(lián)合紫杉醇的化療方案。但大部分患者最終出現(xiàn)對常規(guī)化療藥物耐藥,從而限制了化療藥物的治療效果。所以在過去的幾十年中,卵巢癌的5年生存率仍徘徊在40%左右,并未出現(xiàn)明顯的改善。在臨床的治療過程中,卵巢癌患者的預后很大程度上取決于患者對治療的反應性,化療方案的制定需根據(jù)患者的病情、手術(shù)經(jīng)過、病理診斷等多因素進行綜合評估。而實行個體化的治療方案是目前國內(nèi)外婦科腫瘤醫(yī)師主要的研究目標及方向。 紫杉醇作為卵巢癌治療的一線化療藥物,其主要的抗腫瘤作用為誘導并促進腫瘤細胞的微管聚合,產(chǎn)生穩(wěn)定的微管結(jié)構(gòu),阻止有絲分裂過程中細胞染色體的正常排列及分離,從而抑制細胞周期的進展,最終導致腫瘤細胞凋亡。一般認為,紫杉醇發(fā)揮抗腫瘤效應的重要機制是促進腫瘤細胞微管聚合,抑制腫瘤細胞微管解聚,使細胞分裂阻滯于G2/M期。 在本實驗室的前期研究中,通過RNAi文庫技術(shù)與蛋白質(zhì)免疫共沉淀,質(zhì)譜分析等蛋白質(zhì)組學的研究方式相結(jié)合,在AKT/GSK-3β信號通路中發(fā)現(xiàn)一個新基因KIAA1529可能參與了卵巢癌的紫杉醇耐藥。本研究旨在探討KIAA1529編碼蛋白KA在多種腫瘤細胞系中的表達,并通過藥物干預及RNA干擾技術(shù)探討KA在GSK-3β信號通路中卵巢癌對紫杉醇耐藥的作用及相關(guān)機制,為逆轉(zhuǎn)卵巢癌治療過程中出現(xiàn)的紫杉醇耐藥提供一個可能的新的分子治療靶點。 方法 收集本實驗室相關(guān)腫瘤細胞系,用TRIzol法提取各腫瘤細胞系的總RNA,采用熒光實時定量PCR方法檢測肺癌細胞系、乳腺癌細胞系及卵巢癌細胞系中KIAA1529基因mRNA水平的表達,用蛋白質(zhì)印跡法檢測卵巢癌細胞系中KIAA1529基因編碼蛋白KA的表達。 使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl通過磷酸化抑制GSK-3β,同時在紫杉醇的作用下,采用蛋白質(zhì)印跡法檢測不同處理組卵巢癌SKOV3細胞中GSK-3β、 p-GSK-3β、KA的蛋白表達變化。用流式細胞儀檢測各組細胞周期的變化及各組細胞有絲分裂指數(shù)的改變。采用對SKOV3細胞中的p-H3及α-tubulin進行免疫熒光染色,觀察各組細胞中進行有絲分裂細胞比例的變化及細胞骨架形態(tài)的改變。用流式細胞儀檢測各組理組細胞的凋亡情況。 采用RNA干擾技術(shù),將KA siRNA轉(zhuǎn)染至卵巢癌SKOV3細胞,熒光實時定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染KA siRNA后對SKOV3細胞中KA表達的抑制效果。通過流式細胞儀檢測在使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,在紫杉醇作用下對照組與轉(zhuǎn)染組細胞周期及細胞有絲分裂指數(shù)的變化。采用對對照組及轉(zhuǎn)染組SKOV3細胞中p-H3及α-tubulin的熒光染色,觀察兩組間細胞有絲分裂細胞比例的變化及細胞骨架形態(tài)的改變。用流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡情況。 使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,在紫杉醇作用下,通過蛋白質(zhì)印跡法檢測卵巢癌SKOV3細胞中有絲分裂紡錘體檢測點相關(guān)蛋白的表達變化。采用RNA干擾技術(shù),將KA siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細胞,用蛋白質(zhì)印跡法檢測在使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,紫杉醇作用下,對照組及轉(zhuǎn)染組有絲分裂紡錘體檢測點相關(guān)蛋白的表達變化。 采用RNA干擾技術(shù),將Aurora B siRNA轉(zhuǎn)染至SKOV3細胞,用蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染Aurora B siRNA后,對SKOV3細胞中Aurora B蛋白表達的抑制效果。通過流式細胞儀檢測對照組與轉(zhuǎn)染組細胞有絲分裂指數(shù)的變化。采用對p-H3及a-tubulin的熒光染色,觀察對照組與轉(zhuǎn)染組細胞有絲分裂比例的變化及細胞骨架形態(tài)的改變。用流式細胞儀檢測對照組及轉(zhuǎn)染組細胞凋亡情況。 結(jié)果 1.通過熒光實時定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)KIAA1529基因在肺癌,乳腺癌及卵巢癌細胞系中均有表達。通過蛋白質(zhì)印跡法檢測,發(fā)現(xiàn)KIAA1529基因編碼蛋白KA在卵巢癌SKOV3、A2780、C13K及OV2008細胞系中均有表達。在卵巢病變組織中,良性病變組織中KA的表達高于惡性腫瘤組織,并且在惡性病變組中,低分化腫瘤組織中KA比高分化及中分化的腫瘤組織中表達明顯降低。 2.蛋白質(zhì)印跡法檢測提示,GSK-3β特異性抑制劑LiCl能明顯增加p-GSK-3p蛋白的表達。同時LiCl及紫杉醇共同處理組,比單獨使用紫杉醇處理組KA蛋白的表達明顯升高。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后能減弱紫杉醇對卵巢癌SKOV3細胞的G2/M期阻滯,同時有絲分裂指數(shù)降低。通過免疫熒光技術(shù)觀察,SKOV3細胞在LiCl與紫杉醇共同作用下,相對于單用紫杉醇處理,阻滯于有絲分裂狀態(tài)的細胞比例明顯減少；同時出現(xiàn)細胞分裂期濃縮核結(jié)構(gòu)及圓形細胞骨架結(jié)構(gòu)的細胞比例明顯減少。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)LiCl與紫杉醇共同作用組,凋亡率較單用紫杉醇處理組降低。兩組差異均有統(tǒng)計學意義。 3.熒光實時定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染KA siRNA后,卵巢癌SKOV3細胞中KA的mRNA與蛋白的表達顯著下調(diào),對KA表達的抑制效果明顯。通過流式細胞儀檢測,同樣在LiCl與紫杉醇的作用下,轉(zhuǎn)染組G2/M期阻滯較對照組明顯,同時有絲分裂指數(shù)升高。通過免疫熒光技術(shù)觀察,在LiCl與紫杉醇共同作用下,轉(zhuǎn)染組阻滯于有絲分裂狀態(tài)的細胞比例升高；通過對α-tubulin的熒光染色發(fā)現(xiàn),相對于對照組,轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)細胞分裂期濃縮核結(jié)構(gòu)及圓形細胞骨架結(jié)構(gòu)的細胞比例明顯升高。且流式細胞儀檢測,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率明顯升高。組間差異均有明顯統(tǒng)計學意義。 4.使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,在紫杉醇作用下,蛋白質(zhì)印跡法檢測有絲分裂紡錘體檢測點相關(guān)蛋白Aurora A、Aurora B、BUBR1、MAD2、CDC20,結(jié)果顯示使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后,在紫杉醇作用下,MAD2及CDC20的表達無明顯變化,僅有Aurora A、Aurora B、BUBR1蛋白出現(xiàn)相應的表達變化。在LiCl與紫杉醇共同作用下,相對于單用紫杉醇,Aurora A、Aurora B、BUBR1蛋白的表達均下調(diào)。轉(zhuǎn)染KA siRNA后,在LiCl與紫杉醇的聯(lián)合作用下,轉(zhuǎn)染組與對照組相比,Aurora A與BUBR1蛋白的表達無明顯改變,而Aurora B蛋白表達在轉(zhuǎn)染組抑制KA表達后上調(diào)。 5.蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Aurora B siRNA后,卵巢癌SKOV3細胞中Aurora B蛋白的表達顯著下調(diào),對Aurora B表達的抑制效果明顯。流式細胞儀檢測結(jié)果表明,單用紫杉醇處理后,相對于對照組,轉(zhuǎn)染組細胞有絲分裂指數(shù)下,降。免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對照組相比較,轉(zhuǎn)染組處于有絲分裂狀態(tài)的細胞減少,同時轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)細胞分裂期濃縮核結(jié)構(gòu)及圓形細胞骨架結(jié)構(gòu)的細胞比例明顯減少。經(jīng)流式細胞儀檢測,相對于對照組,轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染Aurora B siRNA后,在紫杉醇的作用下,凋亡率下降。 結(jié)論 新基因KIAA1529編碼及其編碼蛋白KA在卵巢癌細胞系中均有不同程度的表達。在卵巢病變組織中發(fā)現(xiàn)的KA表達差異顯示,新基因KIAA1529編碼蛋白KA與卵巢癌的分化有密切關(guān)系。 在GSK-3β信號通路中,通過GSK-3β特異性抑制劑LiCl作用于卵巢癌SKOV3細胞,使細胞中的GSK-3β磷酸化從而達到抑制GSK-3β的效果。當細胞中的GSK-3β通過磷酸化被抑制后,在紫杉醇的作用下,SKOV3細胞中KA蛋白的表達升高,同時出現(xiàn)紫杉醇所誘導的卵巢癌SKOV3細胞G2/M期阻滯的效應減弱,使腫瘤細胞從紫杉醇所誘導的有絲分裂阻滯狀態(tài)中逃逸,最終紫杉醇誘導的卵巢癌腫瘤細胞凋亡減少,從而產(chǎn)生對紫杉醇的耐藥。 而當通過RNA干擾技術(shù)抑制KA蛋白的表達后,逆轉(zhuǎn)了上述通過LiCl磷酸化抑制GSK-3p產(chǎn)生的卵巢癌SKOV3細胞的紫杉醇耐藥現(xiàn)象。說明通過磷酸化抑制GSK-3β所出現(xiàn)的卵巢癌細胞對紫杉醇耐藥機制,可能是通過新基因編碼蛋白KA的表達升高產(chǎn)生的。 實驗進一步證實,GSK-3β通過LiCl磷酸化被抑制后,在紫杉醇的作用下KA表達升高的同時,抑制了染色體過客蛋白復合物之一Aurora B蛋白的表達；而當通過RNA干擾技術(shù)抑制KA蛋白的表達,Aurora B蛋白的表達恢復。說明了KA表達的升高抑制了染色體過客蛋白Aurora B的表達,破壞了有絲分裂紡錘體檢測點的功能,從而使細胞逃逸了紫杉醇誘導的有絲分裂阻滯,造成卵巢癌腫瘤細胞對紫杉醇的耐藥。 綜上所述,本實驗首次在卵巢癌細胞中對新基因KIAA1529編碼蛋白KA的功能進行了初步的闡述。說明在GSK-3β信號通路中,KA作為GSK-3β的下游調(diào)控因子之一,通過對染色體過客蛋白復合物關(guān)鍵蛋白Aurora B表達的調(diào)節(jié),參與了卵巢癌紫杉醇耐藥；同時通過KA,也將GSK-3β信號通路與有絲分裂紡錘體檢測點功能聯(lián)系起來。因此,新基因KIAA1529編碼的大分子蛋白KA可能成為逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥的新的分子治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 張三泉,彭宏,宋蘭英,李先茂,蔣會勇,姚開泰,趙彤;組織芯片技術(shù)檢測人鼻咽癌組織及細胞株KIAA1173基因的表達[J];癌癥;2005年11期

2 郝星;周志剛;葉雙梅;周婷;盧運萍;馬丁;王世宣;;Effect of Mad2 on Paclitaxel-induced Cell Death in Ovarian Cancer Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2010年05期

3 王麗;楊賓烈;郝星;馬湘一;翁丹卉;廖書杰;盧運萍;王世宣;于洪濤;馬丁;;紫杉醇對卵巢癌細胞作用的濃度依賴性及其機制探討[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2008年02期

4 任利容;梁銘霖;肖蘭;王澤華;;Aurora B基因沉默對卵巢癌細胞A2780紫杉醇化療敏感性的影響[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2011年06期

，

本文編號：1539498