發(fā)布時(shí)間：2018-02-24 21:16

  本文關(guān)鍵詞： 皮秒脈沖電場(chǎng) 宮頸癌動(dòng)物模型 凋亡 有效性 安全性　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女的身心健康。宮頸癌現(xiàn)有的治療方式已經(jīng)比較成熟，然而都不同程度的影響了患者的生育能力或正常組織器官的功能。近年來(lái)，宮頸癌患者的發(fā)病年齡逐漸出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，而年輕患者保留生育功能的愿望更為迫切。因此，尋求更多可抑制或殺傷腫瘤，同時(shí)減少創(chuàng)傷的治療手段成為目前宮頸癌治療的研究熱點(diǎn)。 脈沖電場(chǎng)(Pulsed Electric Fields, PEF)的出現(xiàn)備受生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。前期研究表明，當(dāng)微秒級(jí)和納秒級(jí)脈沖電場(chǎng)作用于腫瘤細(xì)胞后，可以產(chǎn)生協(xié)同化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，甚至可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，為腫瘤應(yīng)用脈沖電場(chǎng)治療奠定了基礎(chǔ)。然而，微秒級(jí)和納秒級(jí)的脈沖電場(chǎng)在治療腫瘤時(shí)，需通過電極針為載體才能達(dá)到治療部位發(fā)揮作用。這種方法在一定程度上限制了脈沖電場(chǎng)在臨床的應(yīng)用。如果脈沖電場(chǎng)可以克服這個(gè)缺點(diǎn)，能無(wú)創(chuàng)引導(dǎo)進(jìn)入患者體內(nèi)，那么脈沖電場(chǎng)在臨床的應(yīng)用才能更為廣泛和可行。因此，具有穿透性及靶向性的皮秒脈沖電場(chǎng)（Picosecond pulsed electric fields，psPEF）本課題由國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81172123)資助為腫瘤的治療提供了新的思路，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于psPEF治療腫瘤的相關(guān)研究較少。根據(jù)脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞作用的窗口效應(yīng)及微秒脈沖的電穿孔效應(yīng)和納秒脈沖的細(xì)胞內(nèi)處理效應(yīng)，從理論上講，脈寬較低的皮秒級(jí)脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞的主要作用應(yīng)該在細(xì)胞器水平，而線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。另外皮秒脈沖電場(chǎng)還具有以下優(yōu)點(diǎn)：高時(shí)間分辨率、高空間分辨率、在傳播過程中保持輸入脈沖的沖激特性、在靶點(diǎn)區(qū)域具有很高的分辨率。匹配超寬帶沖激脈沖輻射天線（Impulse radiating antenna，IRA）所產(chǎn)生的皮秒脈沖電場(chǎng)可以向指定的范圍傳輸能量，將脈沖電磁波匯聚于目標(biāo)組織，甚至可以使靶點(diǎn)組織發(fā)生壞死。在傳播過程中IRA的輻射能量在空間、時(shí)間上都很集中。如果能夠利用IRA將皮秒脈沖電場(chǎng)輸送進(jìn)入腫瘤組織，便有可能實(shí)現(xiàn)腫瘤的無(wú)創(chuàng)治療。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)皮秒脈沖電場(chǎng)可誘發(fā)Hela細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑活化caspases（Cysteine-containing aspartate-specific proteases，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶類）依賴的細(xì)胞凋亡途徑而誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，而體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)受神經(jīng)、體液等多方面因素的影響，因此，有必要在細(xì)胞學(xué)研究水平的基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)宮頸癌模型動(dòng)物在體腫瘤的治療機(jī)制是否同樣是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并觀察其治療的有效性和安全性，研究結(jié)果對(duì)于其臨床應(yīng)用的進(jìn)一步研究具有指導(dǎo)意義。 本課題構(gòu)建裸鼠宮頸癌動(dòng)物模型作為在體實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，以前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，對(duì)皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型的機(jī)制及有效性安全性進(jìn)行初步研究，目的是為皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌的可行性及進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究提供較為直接的依據(jù)。研究共分為三部分。 第一部分皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的研究 第一節(jié)裸鼠宮頸癌動(dòng)物模型的構(gòu)建 目的：構(gòu)建裸鼠宮頸癌荷瘤動(dòng)物模型。 方法：將制備好的Hela細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部皮下,每鼠0.2ml。1周后可捫及皮下結(jié)節(jié)，大約需2周待腫瘤最大直徑約0.5-0.8cm時(shí),取腫瘤組織作移植瘤模型，約2周移植瘤直徑達(dá)1.0cm左右。將成功移植腫瘤的荷瘤小鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求分為對(duì)照組、治療組。 結(jié)果：成功建立人宮頸癌荷瘤動(dòng)物模型。 第二節(jié)皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型適宜參數(shù)的篩選 目的：研究并篩選psPEF治療宮頸癌荷瘤動(dòng)物模型的適宜參數(shù)。 方法：根據(jù)前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定參數(shù)并分為三個(gè)不同電壓作用的實(shí)驗(yàn)組(50kV組，60kV組，70kV組)，固定參數(shù)為：脈沖個(gè)數(shù)2000個(gè)，脈寬800ps，頻率3Hz。使用鑷型電極無(wú)創(chuàng)傳導(dǎo)皮秒脈沖電場(chǎng)治療荷瘤動(dòng)物模型，脈沖電場(chǎng)治療后24h處死動(dòng)物，取腫瘤組織，采用TTC染色法染色腫瘤組織，測(cè)量并計(jì)算壞死腫瘤組織體積。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果篩選適宜的治療宮頸癌動(dòng)物模型的皮秒脈沖電場(chǎng)參數(shù)。 結(jié)果：皮秒脈沖電場(chǎng)治療荷瘤動(dòng)物模型腫瘤組織后，通過TTC染色法，可觀察到隨著電壓的增高，腫瘤組織呈蒼白色的區(qū)域逐漸增大。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明各電壓組壞死組織長(zhǎng)徑、寬徑均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；50kV組與60kV組壞死組織的厚度無(wú)差異；50kV組與70kV組壞死組織的厚度相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；三組之間壞死組織體積相比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。 結(jié)論：皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型后，隨著電壓增高，腫瘤組織的壞死程度逐漸加重。因此，皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型的適宜參數(shù)為：脈沖個(gè)數(shù)2000個(gè)、脈寬800ps、頻率3Hz、電壓70kV。 第三節(jié)皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的研究 目的：觀察皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，初步探討其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)理。 方法：將宮頸癌動(dòng)物模型分為四個(gè)組，即對(duì)照組和治療組(脈沖治療后6h組、脈沖治療后12h組、脈沖治療后24h組)，固定參數(shù)為：脈沖個(gè)數(shù)2000個(gè)，脈寬800ps，電壓70kV，頻率3Hz。使用鑷型電極無(wú)創(chuàng)傳導(dǎo)皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型。應(yīng)用HE染色法觀察腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。采用透射電子顯微鏡觀察對(duì)照組和治療組腫瘤組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。TUNEL試劑盒檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡率；激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤組織線粒體的跨膜電位變化；采用caspase-3，caspase-8，caspase-9，caspase-12活性測(cè)定試劑盒分別測(cè)定caspase-3，caspase-8，caspase-9，caspase-12的活性。 結(jié)果：組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示對(duì)照組腫瘤組織無(wú)明顯細(xì)胞壞死，而治療組均有細(xì)胞壞死，且隨治療后時(shí)間的延長(zhǎng)壞死程度逐漸加重。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示對(duì)照組腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出輕微的線粒體腫脹，而治療后6h組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)早期凝固性壞死，治療后12h組出現(xiàn)顯著的凝固性壞死和多個(gè)凋亡小體，治療后24h組出現(xiàn)更為顯著的凝固性壞死和少量凋亡小體。TUNEL檢測(cè)腫瘤組織的細(xì)胞凋亡率結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各治療組的腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著升高(P0.01)，治療后12h組的細(xì)胞凋亡率顯著高于其他治療組(P0.01)，治療后6h組與治療后24h組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。激光共聚焦顯微鏡下觀察各組線粒體跨膜電位的結(jié)果表明，從對(duì)照組到治療后6h組、治療后12h組，紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強(qiáng)，但是治療后24h組兩種熒光均明顯減弱。試劑盒測(cè)定caspase-3，caspase-8，caspase-9，caspase-12活性結(jié)果顯示，治療組caspase-3和caspase-12的活性升高，各組caspase-3與caspase-12活性結(jié)果趨勢(shì)相似，均為治療后12h組治療后24h組治療后6h組=對(duì)照組，各組caspase-8和caspase-9活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：psPEF可使用鑷型電極引導(dǎo)至宮頸癌動(dòng)物模型的腫瘤部位，殺傷腫瘤細(xì)胞，在此過程中線粒體膜電位下降及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑激活誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮了作用。 第二部分皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型的有效性研究 目的：觀察皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型后腫瘤體積的變化、相對(duì)腫瘤增殖率及生存曲線。 方法：將宮頸癌動(dòng)物模型分為對(duì)照組和治療組，皮秒脈沖電場(chǎng)的參數(shù)為：脈沖個(gè)數(shù)2000個(gè)，脈寬800ps，頻率3Hz，電壓：70kV。使用鑷型電極無(wú)創(chuàng)傳導(dǎo)皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型。觀察裸鼠精神狀態(tài)及腫瘤組織的生長(zhǎng)情況。每3天測(cè)量1次裸鼠的腫瘤體積。根據(jù)腫瘤體積測(cè)量的結(jié)果計(jì)算相對(duì)腫瘤增殖率。治療組和對(duì)照組的動(dòng)物模型在同等條件下飼養(yǎng)，自然生存并記錄死亡時(shí)間，制作生存曲線。 結(jié)果：對(duì)照組與治療組腫瘤最早分別于第24天，第58天發(fā)生破潰。治療組腫瘤體積在治療后3天、6天、9天與對(duì)照組比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有差異，12天以后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療組相對(duì)腫瘤增殖率在治療后3天、6天、9天分別為76.87%、71%、68.87%。生存時(shí)間觀察顯示對(duì)照組為（41-92）天，治療組為（70-118）天。兩組荷瘤動(dòng)物的生存曲線無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：提示皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型腫瘤對(duì)其生長(zhǎng)有抑制作用。但遠(yuǎn)期抑制效應(yīng)不明顯。 第三部分皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型的安全性研究 第一節(jié)皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)宮頸癌動(dòng)物模型腫瘤周圍組織的影響 目的：觀察皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)宮頸癌動(dòng)物模型腫瘤周圍正常皮膚及皮下組織的影響。 方法：將宮頸癌動(dòng)物模型分為四個(gè)組，即對(duì)照組和治療組(脈沖治療后6h組、脈沖治療后12h組、脈沖治療后24h組)，固定參數(shù)為：脈沖個(gè)數(shù)2000個(gè)，脈寬800ps，電壓70kV，頻率3Hz。使用鑷型電極無(wú)創(chuàng)傳導(dǎo)皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型。取電極接觸部位的動(dòng)物皮膚及皮下組織，采用HE染色觀察其組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用透射電子顯微鏡分別觀察對(duì)照組和治療組動(dòng)物模型皮膚及皮下組織的超微結(jié)構(gòu)，用DNAladder觀察有無(wú)凋亡現(xiàn)象。 結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組及治療組的皮膚及皮下組織均無(wú)明顯壞死。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示對(duì)照組及治療組電極接觸部位的皮膚表皮和真皮層結(jié)構(gòu)均無(wú)破壞，未見壞死。治療后6h組表皮纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，基底細(xì)胞線粒體輕度腫脹，血管內(nèi)皮細(xì)胞正常。治療后12h組表皮纖維細(xì)胞正常，胞膜、核膜完整，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹。治療后24h組表皮結(jié)構(gòu)正常，多泡脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，血管結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮細(xì)胞未見腫脹。對(duì)照組及治療組未見DNAladder條帶。 結(jié)論：皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型后脈沖傳導(dǎo)所經(jīng)過的皮膚及皮下組織未見細(xì)胞凋亡、損傷與壞死。 第二節(jié)皮秒脈沖電場(chǎng)治療對(duì)宮頸癌動(dòng)物模型重要臟器的影響 目的：觀察皮秒脈沖電場(chǎng)治療對(duì)宮頸癌動(dòng)物模型重要臟器的影響。 方法：將宮頸癌動(dòng)物模型分為對(duì)照組和治療組，脈沖參數(shù)為：脈沖個(gè)數(shù)2000，，脈寬800ps，頻率3Hz，電壓70kV。使用鑷型電極無(wú)創(chuàng)傳導(dǎo)皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型。脈沖治療后24h，采血并取裸鼠的心臟、肝臟、腎臟。分別采用乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)測(cè)定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)測(cè)定試劑盒、尿素氮(BUN)測(cè)定試劑盒測(cè)定心臟、肝臟及腎臟功能。采用HE染色觀察脈沖治療后荷瘤動(dòng)物心臟、肝臟及腎臟的組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果：皮秒脈沖電場(chǎng)治療組宮頸癌動(dòng)物模型的心功能血清學(xué)指標(biāo)LDH，肝功能血清學(xué)指標(biāo)GOT和GPT及腎功能血清學(xué)指標(biāo)BUN活性與對(duì)照組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HE染色顯示治療組荷瘤動(dòng)物模型的心臟、肝臟、腎臟的組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。 結(jié)論：皮秒脈沖電場(chǎng)治療宮頸癌動(dòng)物模型后，裸鼠的心臟、肝臟、腎臟的功能及形態(tài)無(wú)明顯改變，提示皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)裸鼠宮頸癌動(dòng)物模型的重要臟器無(wú)影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.33;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1531740