本文關(guān)鍵詞： 卵巢漿液性囊腺癌 Wip1 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞 凋亡 凋亡蛋白 P38MAPK信號(hào)通路 侵襲 小干擾RNA　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤,也是導(dǎo)致女性死亡的常見的惡性腫瘤。由于卵巢癌早期癥狀不典型,絕大多數(shù)患有卵巢癌的女性發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期,腫瘤已擴(kuò)散至卵巢以外的器官,卵巢癌的5年生存率只有30-40%。盡管手術(shù)和化療方案不斷改進(jìn),但是大多數(shù)患者往往會(huì)復(fù)發(fā),預(yù)后很差。因此,卵巢癌嚴(yán)重威脅著廣大女性的身體健康。目前關(guān)于卵巢癌的具體發(fā)病機(jī)制仍然不十分清楚。細(xì)胞凋亡是人體內(nèi)細(xì)胞死亡的主要途徑之一,其過程受機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控,調(diào)控失衡可引起細(xì)胞異常增殖或異常凋亡,導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。研究表明,卵巢癌細(xì)胞凋亡異常是導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。野生型p53誘導(dǎo)的蛋白磷酸酶1(Wild-type p53-induced phosphatase1,Wip1)是1997年發(fā)現(xiàn)的一種依賴于p53的原癌基因,它廣泛參與調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)通路,對(duì)卵巢癌等多種癌癥的發(fā)生起重要作用。Wip1是一種絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶,由PPM1D(Protein phasphatase magnesiumdependent 1 delta)基因編碼,主要定位于細(xì)胞核內(nèi),位于人染色體17q23/q24區(qū)域,是PP2C(protein phosatase type 2C)家族中的一員。研究顯示W(wǎng)ip1基因與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。有研究將大鼠暴露于錳環(huán)境中造成神經(jīng)壞死并制成大鼠模型,通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加而神經(jīng)組織及細(xì)胞中Wip1的表達(dá)量則顯著下降。還有研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌和腎癌組織中Wip1的表達(dá)水平均顯著高于其正常組織,沉默Wip1后兩種癌細(xì)胞的凋亡明顯增加。在He La細(xì)胞中,沉默Wip1顯著降低細(xì)胞的生長和增殖,而細(xì)胞凋亡增加,p-p38 MAPK、p-p53、p53蛋白的表達(dá)也顯著增加。因此,Wip1參與了抑制癌細(xì)胞凋亡的過程。Wip1表達(dá)升高具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。Wip1在乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤組織存在高表達(dá),提示W(wǎng)ip1與惡性腫瘤的關(guān)系密切。關(guān)于Wip1在卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞凋亡中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究目前尚未見報(bào)道。因此,本課題通過免疫組織化學(xué)染色法、Real-Time PCR、Western blot方法觀察Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)情況并分析其與臨床病理特征的關(guān)系,采用小干擾RNA技術(shù)、Real-Time PCR、Western blot、Transwell等技術(shù)研究Wip1對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡、侵襲的影響,以闡明Wip1在卵巢漿液性囊腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。第一部分Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)及意義目的:探討Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)情況以及Wip1與卵巢漿液性囊腺癌臨床病理特征的關(guān)系。方法:選取2012年9月至2014年12月期間河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦科手術(shù)經(jīng)病理檢查確診的患者標(biāo)本80例為研究對(duì)象,其中卵巢漿液性囊腺癌50例,交界性卵巢漿液性囊腺瘤20例和因子宮肌瘤行全子宮+雙側(cè)附件切除術(shù)且病理證實(shí)為正常卵巢組織10例�；颊吣挲g45-67歲之間,中位年齡57歲,所有病例術(shù)前無化療及放療史。按FIGO(2014)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)病理分期:Ⅰ、Ⅱ期20例,Ⅲ、Ⅳ期30例;組織學(xué)分級(jí)按照WHO標(biāo)準(zhǔn):高分化、中分化、低分化分別為21例、7例和22例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例,無轉(zhuǎn)移20例。標(biāo)本取材后部分置于-196℃液氮中速凍,然后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱內(nèi)保存,部分標(biāo)本用10%甲醛固定,石蠟包埋,行免疫組化染色。通過免疫組化技術(shù),RT-PCR及Western blot對(duì)卵巢漿液性囊腺癌組織中的Wip1的表達(dá)進(jìn)行研究,并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行分析,以探討Wip1在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)情況及其與卵巢漿液性囊腺癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織病理分化程度的關(guān)系。結(jié)果:1免疫組化檢測(cè)Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)Wip1表達(dá)于卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞的胞核及胞漿,在卵巢漿液性囊腺癌組織中陽性表達(dá)率為68%,在交界性卵巢漿液性囊腺瘤組織中陽性表達(dá)率為60%,在正常卵巢上皮細(xì)胞中未見表達(dá),三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(確切概率法P=0.001)。2 RT-PCR檢測(cè)Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)Wip1m RNA表達(dá)在卵巢漿液性囊腺癌(3.1±0.19)高于正常卵巢組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);在交界性卵巢漿液性囊腺瘤(2.5±0.23)較正常卵巢組織增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)與交界性卵巢漿液性囊腺瘤中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 Western blot檢測(cè)Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)Wip1蛋白表達(dá)在卵巢漿液性囊腺癌(0.81±0.15)高于正常卵巢組織(0.45±0.22),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在交界性卵巢漿液性囊腺瘤(0.82±0.19)高于正常卵巢組織(0.45±0.22),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)與交界性卵巢漿液性囊腺瘤中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4 Wip1表達(dá)與卵巢漿液性囊腺癌臨床病理特征的關(guān)系4.1 Wip1表達(dá)與臨床病理分期的關(guān)系分為Ⅰ、Ⅱ期組及Ⅲ、Ⅳ期組兩組,Wip1在兩組卵巢漿液性囊腺癌組織中的陽性表達(dá)率分別為50%及80%,隨著臨床期別的升高Wip1的陽性表達(dá)率逐漸增加,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.963,P=0.026)。4.2 Wip1表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系Wip1在高分化、中分化、低分化卵巢漿液性囊腺癌組織中陽性表達(dá)率分別為52.38%、71.43%及81.82%,三組比較陽性表達(dá)率呈增高趨勢(shì),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(確切概率法P=0.118)。4.3 Wip1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Wip1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽性表達(dá)率為83.33%,在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中Wip1陽性表達(dá)率為45%,兩組比較有顯著性差異(χ2=8.104,P=0.004)。小結(jié):Wip1在卵巢漿液性囊腺癌組織中高表達(dá),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)。表明Wip1參與了卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程,為卵巢漿液性囊腺癌發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的理論依據(jù)。第二部分Wip1在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)、篩選與沉默目的:探討Wip1在不同卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,篩選出Wip1強(qiáng)表達(dá)的細(xì)胞系,為進(jìn)一步研究Wip1在卵巢癌細(xì)胞系中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:應(yīng)用RT-PCR及Western blot檢測(cè)正常卵巢上皮細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、CAOV3、A2780、ES2中Wip1m RNA及蛋白的表達(dá)。最終篩選出SKOV3作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中沉默Wip基因觀察其生物學(xué)行為的變化。在體外合成Wip1特異性的三對(duì)si RNA(Wip1-si RNA-1、Wip1-si RNA-2、Wip1-si RNA-3),一對(duì)si RNA陰性對(duì)照。Lipofectamine2000介導(dǎo)si RNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)Control組(SKOV3細(xì)胞組)(2)N-si RNA組:轉(zhuǎn)染陰性si RNA(3)實(shí)驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-si RNA(1、2、3)者。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Wip1蛋白表達(dá)的變化,并選擇出最有效的Wip1-si RNA-2做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照操作步驟每組設(shè)置好相應(yīng)平行孔,將各組細(xì)胞依次分別接種至96孔板,培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分別于轉(zhuǎn)染后0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Wip1蛋白表達(dá)的變化;選用si RNA的濃度分別是20nmol/L,40nmol/L,80nmol/L時(shí)作用SKOV3細(xì)胞,Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Wip1蛋白表達(dá)的變化,篩選出Wip1-si RNA-2作用的最佳時(shí)間(48h)及Wip1-si RNA-2作用的最佳濃度(80nmol/L)。結(jié)果:1 Real-time PCR檢測(cè)卵巢正常上皮細(xì)胞、SKOV3、CAOV3、A2780、ES2細(xì)胞株中Wip1m RNA表達(dá)Wip1m RNA表達(dá)在SKOV3細(xì)胞中(3.85±0.23)明顯高于正常上皮細(xì)胞,有顯著性差異(P0.01),在CAOV3(1.73±0.46)、A2780(1.89±0.28)、ES2(1.81±0.19)細(xì)胞中也均高于卵巢正常上皮細(xì)胞,有顯著性差異(P0.05)。2 Western blot檢測(cè)卵巢正常上皮細(xì)胞、SKOV3、CAOV3、A2780、ES2細(xì)胞株中Wip1蛋白的表達(dá)Wip1蛋白表達(dá)在SKOV3(0.73±0.09)、A2780(0.54±0.039)、ES2(1.17±0.08)細(xì)胞中明顯高于正常上皮細(xì)胞(0.15±0.038),有顯著性差異(P0.01),在CAOV3(0.25±0.045)細(xì)胞中也高于卵巢正常上皮細(xì)胞,有顯著性差異(P0.05)。通過檢測(cè)SKOV3、CAOV3、AZ780、ES2細(xì)胞中Wip1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Wip1在SKOV3細(xì)胞中m RNA與蛋白的表達(dá)明顯高于其他三種細(xì)胞,因此后續(xù)采用SKOV3細(xì)胞進(jìn)一步研究Wip1與卵巢漿液性囊腺癌的關(guān)系。3沉默Wip1對(duì)SKOV3細(xì)胞的影響轉(zhuǎn)染si RNA-2的SKOV3細(xì)胞中Wip1蛋白表達(dá)最少,Wip1-si RNA-2轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后,Wip1的表達(dá)隨著其濃度的增加呈減少趨勢(shì),在濃度為80nmol/L達(dá)到最低值;而作用時(shí)間為48小時(shí)Wip1蛋白表達(dá)也達(dá)到最低。提示,Wip1-si RNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞在特定濃度和作用時(shí)間時(shí)影響最大(P0.01)。小結(jié):在SKOV3、CAOV3、A2780、ES2細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)Wip1有過表達(dá)現(xiàn)象,其在SKOV3細(xì)胞中表達(dá)水平最高,Wip1-si RNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞在特定濃度和作用時(shí)間時(shí)沉默效果最好,為進(jìn)一步闡述其分子機(jī)制提供了理論支持。第三部分沉默Wip1對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響目的:探討沉默Wip1對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)的分子機(jī)制。方法:AnnexinⅤ/PI染色檢測(cè)Control組、N-si RNA組、Wip1-si RNA(2)(Wip1-si RNA)組中SKOV3細(xì)胞凋亡率。RT-PCR檢測(cè)Control組、N-si RNA組、Wip1-si RNA組中Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2m RNA的表達(dá)。Western blot檢測(cè)Control組、N-si RNA組、Wip1-si RNA組中Bcl-2、Bax、P53、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、p38 MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)。為明確p38 MAPK信號(hào)通路是否參與了SKOV3細(xì)胞凋亡,加入P38 MAPK特異性抑制劑SB203580后檢測(cè)p-p38及p38的表達(dá)情況。結(jié)果:1流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)沉默Wip1對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響AnnexinⅤ/PI染色結(jié)果表明,與Control組相比,Wip1-si RNA組沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞凋亡率顯著增加(P0.01);與N-si RNA組相比,Wip1-si RNA組SKOV3細(xì)胞凋亡率也顯著增加(P0.01)。此外,N-si RNA組與Control組相比SKOV3細(xì)胞的凋亡率無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2 RT-PCR檢測(cè)沉默Wip1對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響為研究沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞凋亡發(fā)生情況,對(duì)凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),沉默Wip1后,SKOV3細(xì)胞中P53m RNA(2.5±0.034)較Control組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);Bax/Bcl-2及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值較Control組則明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)果提示:沉默Wip1后能夠促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。3 Western blot檢測(cè)沉默Wip1對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為研究沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞凋亡發(fā)生情況,對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),沉默Wip1后,SKOV3細(xì)胞中P53蛋白(1.02±0.039)較Control組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);Bax/Bcl-2及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值較Control組則明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)果提示:沉默Wip1后能夠促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。4沉默Wip1通過p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞的凋亡沉默Wip1后檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-P38的蛋白表達(dá),P-P38的蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示P-P38可能參與了SKOV3細(xì)胞的凋亡。為明確p38 MAPK信號(hào)通路是否參與了SKOV3細(xì)胞的凋亡,加入P38MAPK的特異性抑制劑SB203580,p-p38的蛋白表達(dá)則明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。小結(jié):沉默Wip1能夠促進(jìn)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡可能是通過上調(diào)P53、cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2比率,活化P38MAPK信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。第四部分沉默Wip1對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響目的:探討Wip1與卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲力的關(guān)系,揭示W(wǎng)ip1對(duì)SKOV3細(xì)胞的侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為的影響。方法:劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室法測(cè)定Wip1沉默后SKOV3細(xì)胞體外侵襲能力。RT-PCR檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2m RNA的表達(dá);Western blot檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達(dá)結(jié)果:1劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定Wip1-si RNA沉默Wip1基因?qū)KOV3細(xì)胞體外侵襲能力的影響Wip1-si RNA組細(xì)胞遷移距離(30.333±3.670)明顯短于Control組(59.333±7.685),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);N-si RNA組和Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2 Transwell小室法測(cè)定Wip1-si RNA沉默Wip1基因?qū)KOV3細(xì)胞體外侵襲能力的影響Wip1-si RNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后使其侵襲基底膜能力受到顯著抑制,SKOV3細(xì)胞侵襲到Transwell小室濾膜下細(xì)胞數(shù)Wip1-si RNA組為(17.167±1.835),顯著低于Control組(31.167±3.43)和N-si RNA組(29.667±4.179),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);N-si RNA組和Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 RT-PCR檢測(cè)沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2m RNA的表達(dá)Wip1-si RNA組MMP-2m RNA(0.51±0.013)和MMP-9 m RNA(0.4±0.028)的表達(dá)較Control組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);Wip1-si RNA組TIMP-1m RNA(0.98±0.015)和TIMP-2 m RNA(0.97±0.029)的表達(dá)較Control組無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4 Western blot檢測(cè)沉默Wip1后SKOV3細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達(dá)Wip1-si RNA組MMP-2蛋白(0.43±0.049)和MMP-9蛋白(0.31±0.052)的表達(dá)較Control組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);Wip1-si RNA組TIMP-1蛋白(0.9±0.033)和TIMP-2蛋白(0.8±0.039)的表達(dá)較Control組無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。小結(jié):沉默Wip1能夠抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲能力,可能是通過抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：1526077