本文關(guān)鍵詞： 多囊卵巢綜合征 AQP7 AQP9 胰島素抵抗 卵泡發(fā)育 顆粒細(xì)胞　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)在我國育齡期女性發(fā)病率為5%~10%,是一種合并糖代謝紊亂與生殖功能障礙的復(fù)雜疾病,目前其發(fā)病機制尚不清楚。研究認(rèn)為PCOS可能是由于遺傳基因變異與不良環(huán)境相互作用所致,是一種較復(fù)雜的多基因遺傳病。而且其引起的排卵障礙性不孕癥卻是生殖領(lǐng)域面臨的難題之一。雖然輔助生殖技術(shù)已經(jīng)是治療PCOS性不孕癥的常規(guī)方法,但是由于其糖代謝和內(nèi)分泌紊亂導(dǎo)致的卵泡發(fā)育異常,常常出現(xiàn)PCOS患者在行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)過程中卵子成熟度和胚胎質(zhì)量差,導(dǎo)致卵子利用率和胚胎種植率降低。而且PCOS患者常出現(xiàn)月經(jīng)紊亂、不孕和肥胖等,后期患心血管疾病和2型糖尿病的發(fā)病幾率也明顯增加,嚴(yán)重威脅患者的生理及心理健康。因此,明確PCOS患者卵泡發(fā)育不良的機制是亟待解決的問題,是目前生殖領(lǐng)域的研究熱點。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一組存在于細(xì)胞膜上的小分子蛋白家族,可使細(xì)胞膜對水的通透性增加,對維持細(xì)胞內(nèi)外的水平衡意義重大。目前研究者已發(fā)現(xiàn)有11種AQPs(AQP0-AQP10)豐富地表達于哺乳動物多種組織細(xì)胞中,并參與精子發(fā)生、卵泡發(fā)育成熟、囊胚形成、胚胎著床等多種生殖過程,其在生殖領(lǐng)域的作用已經(jīng)越來越受到關(guān)注。其分為三類亞家族:第一類即經(jīng)典水通道蛋白:包括AQP0-2、AQP4-6和AQP8,對水具有高度選擇性,主要負(fù)責(zé)水分子的運輸;第二類是綜合型水通道,包括AQP3、AQP7、AQP9和AQP10,可以運輸水、尿素和甘油等一些中性小分子物質(zhì),又稱為甘油-水通道蛋白。第三類是超級水通道蛋白,包括AQP11和AQP12,目前其結(jié)構(gòu)和功能研究還不明確。早期的研究顯示:AQP1-4 mRNA在人類不同發(fā)育時期卵泡顆粒細(xì)胞中的表達量不同。最近研究顯示:正常女性的顆粒細(xì)胞中只有AQP1、7、9、11和12mRNA表達,而且AQP7mRNA的表達水平和受精率呈正相關(guān),推測AQP7的表達可能是正常卵泡生成和健康卵母細(xì)胞的標(biāo)志物。譚雅靜等研究發(fā)現(xiàn),AQP7在小鼠和正常人卵母細(xì)胞中表達,且可以提高玻璃化冷凍卵母細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。有研究顯示在肥胖女性與貧困婦女相比,肥胖女性的AQP7的表達水平較低,mRNA水平與BMI呈負(fù)相關(guān)。也有學(xué)者報道PCOS患者大網(wǎng)膜脂肪組織中AQP7mRNA和蛋白表達顯著高于對照組,且與空腹胰島素水平呈現(xiàn)正相關(guān)性,推測PCOS脂肪組織中的AQP7過表達可能與胰島素敏感性及維持全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關(guān)。以上研究結(jié)果提示AQP7在甘油轉(zhuǎn)運和能量代謝過程中起重要作用。但是,AQP7在PCOS患者顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的表達及其與胰島素的相關(guān)性,目前尚未見報道。研究證實在卵泡發(fā)育過程中,AQP9表達于竇狀卵泡和顆粒細(xì)胞中。而AQP9在PCOS患者中表達目前結(jié)論也尚存爭議:有研究報道在PCOS患者和對照組的顆粒細(xì)胞中均檢測到AQP9mRNA表達,兩者之間無顯著差異;但是也有學(xué)者報道AQP9mRNA表達水平在PCOS組明顯低于正常組。在動物實驗方面:最近研究發(fā)現(xiàn)在綿羊卵巢組織玻璃化冷凍過程中,AQP9對維持卵泡細(xì)胞內(nèi)外的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。有學(xué)者報道AQP3,8和9mRNA在小鼠成熟卵母細(xì)胞中表達;也有研究發(fā)現(xiàn)AQP9mRNA在大鼠卵母細(xì)胞成熟過程中逐漸消失。以上研究結(jié)果提示AQP9可能在卵母細(xì)胞成熟的過程中起重要作用。但是,AQP9在PCOS患者顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的表達及其與胰島素的相關(guān)性尚需研究進一步證實。綜上所述,深入研究AQP7和AQP9在PCOS患者卵泡發(fā)育中的作用及功能研究不僅有助于PCOS發(fā)病過程中的病理生理研究,也將為其臨床診治提供新的思路。目的:本研究采用Real-time qPCR和Western-Blot等分子生物學(xué)方法檢測PCOS組和對照組顆粒細(xì)胞中AQP7和AQP9的表達,探討其在各組顆粒細(xì)胞中的表達特點;通過檢測各時期卵母細(xì)胞中AQP7和AQP9的定位,探討其對卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的影響;通過添加不同濃度胰島素及不同處理時間對體外培養(yǎng)正常人壁層顆粒細(xì)胞進行干預(yù),探討胰島素對顆粒細(xì)胞中AQP7和AQP9表達的調(diào)控作用。方法:1.將收集到的各組卵巢組織做成病理切片,取出一部分行HE染色,鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)并拍照,比較各組卵巢結(jié)構(gòu)特點;另一部分采用免疫組化法比較各組卵巢組織AQP7和AQP9分布情況及積分光密度值(integrated optical density,IOD)。2.分組:分為PCOS組和對照組。不同方法檢測各組壁層顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞中AQP7和AQP9表達水平。采用Real-time qPCR技術(shù)檢測各組AQP7和AQP9基因表達水平;采用Western-Blot技術(shù)檢測各組AQP7和AQP9蛋白的表達。3.采用免疫熒光技術(shù)檢測各時期卵母細(xì)胞中AQP7和AQP9的定位,探討其在卵母細(xì)胞發(fā)育過程的作用。4.體外培養(yǎng)正常人壁層顆粒細(xì)胞,分別添加不同濃度胰島素及不同處理時間進行干預(yù),檢測干預(yù)后AQP7和AQP9基因及蛋白的表達變化,探討胰島素對顆粒細(xì)胞中AQP7和AQP9表達的調(diào)控。結(jié)果:1.AQP7蛋白及mRNA在PCOS組卵巢組織和各層顆粒細(xì)胞中的表達均明顯高于對照組(P0.05);AQP7蛋白定位于人類各時期卵母細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上。2.AQP9在PCOS組卵巢組織中的表達顯著高于對照組(P0.05);而在PCOS組各層顆粒細(xì)胞中的表達顯著低于對照組(P0.05);AQP9蛋白定位于人類各時期卵母細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上。3.隨著胰島素濃度的增加,與對照組相比,AQP7和AQP9 mRNA和蛋白的表達呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)胰島素濃度為100nmol/L時,其表達量下降最明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.100nmol/L胰島素作用于正常體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞6~24h后,與對照組相比,AQP7和AQP9在12h表達量最低(P0.05)。結(jié)論:1.AQP7在PCOS患者卵巢組織和顆粒細(xì)胞中均高表達及在各期卵母細(xì)胞中表達,提示AQP7可能參與PCOS患者卵泡的生長發(fā)育過程。2.AQP9在PCOS患者卵巢組織中高表達而在顆粒細(xì)胞中低表達,且表達于各期卵母細(xì)胞中,提示AQP9可能參與PCOS患者卵泡的生長發(fā)育過程。3.AQP7和AQP9表達與胰島素呈濃度負(fù)相關(guān);100nmol/L胰島素作用12h AQP7和AQP9表達量最低,提示胰島素可能通過調(diào)控AQP7和AQP9的表達影響卵泡的發(fā)育。
[Abstract]:The pathogenesis of polycystic ovary syndrome ( PCOS ) is 5 % 锝，

本文編號：1519590