本文關鍵詞： 多囊卵巢綜合征 AQP7 AQP9 胰島素抵抗 卵泡發(fā)育 顆粒細胞　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)在我國育齡期女性發(fā)病率為5%~10%,是一種合并糖代謝紊亂與生殖功能障礙的復雜疾病,目前其發(fā)病機制尚不清楚。研究認為PCOS可能是由于遺傳基因變異與不良環(huán)境相互作用所致,是一種較復雜的多基因遺傳病。而且其引起的排卵障礙性不孕癥卻是生殖領域面臨的難題之一。雖然輔助生殖技術已經是治療PCOS性不孕癥的常規(guī)方法,但是由于其糖代謝和內分泌紊亂導致的卵泡發(fā)育異常,常常出現PCOS患者在行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)過程中卵子成熟度和胚胎質量差,導致卵子利用率和胚胎種植率降低。而且PCOS患者常出現月經紊亂、不孕和肥胖等,后期患心血管疾病和2型糖尿病的發(fā)病幾率也明顯增加,嚴重威脅患者的生理及心理健康。因此,明確PCOS患者卵泡發(fā)育不良的機制是亟待解決的問題,是目前生殖領域的研究熱點。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一組存在于細胞膜上的小分子蛋白家族,可使細胞膜對水的通透性增加,對維持細胞內外的水平衡意義重大。目前研究者已發(fā)現有11種AQPs(AQP0-AQP10)豐富地表達于哺乳動物多種組織細胞中,并參與精子發(fā)生、卵泡發(fā)育成熟、囊胚形成、胚胎著床等多種生殖過程,其在生殖領域的作用已經越來越受到關注。其分為三類亞家族:第一類即經典水通道蛋白:包括AQP0-2、AQP4-6和AQP8,對水具有高度選擇性,主要負責水分子的運輸;第二類是綜合型水通道,包括AQP3、AQP7、AQP9和AQP10,可以運輸水、尿素和甘油等一些中性小分子物質,又稱為甘油-水通道蛋白。第三類是超級水通道蛋白,包括AQP11和AQP12,目前其結構和功能研究還不明確。早期的研究顯示:AQP1-4 mRNA在人類不同發(fā)育時期卵泡顆粒細胞中的表達量不同。最近研究顯示:正常女性的顆粒細胞中只有AQP1、7、9、11和12mRNA表達,而且AQP7mRNA的表達水平和受精率呈正相關,推測AQP7的表達可能是正常卵泡生成和健康卵母細胞的標志物。譚雅靜等研究發(fā)現,AQP7在小鼠和正常人卵母細胞中表達,且可以提高玻璃化冷凍卵母細胞復蘇后的存活率。有研究顯示在肥胖女性與貧困婦女相比,肥胖女性的AQP7的表達水平較低,mRNA水平與BMI呈負相關。也有學者報道PCOS患者大網膜脂肪組織中AQP7mRNA和蛋白表達顯著高于對照組,且與空腹胰島素水平呈現正相關性,推測PCOS脂肪組織中的AQP7過表達可能與胰島素敏感性及維持全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關。以上研究結果提示AQP7在甘油轉運和能量代謝過程中起重要作用。但是,AQP7在PCOS患者顆粒細胞和卵母細胞的表達及其與胰島素的相關性,目前尚未見報道。研究證實在卵泡發(fā)育過程中,AQP9表達于竇狀卵泡和顆粒細胞中。而AQP9在PCOS患者中表達目前結論也尚存爭議:有研究報道在PCOS患者和對照組的顆粒細胞中均檢測到AQP9mRNA表達,兩者之間無顯著差異;但是也有學者報道AQP9mRNA表達水平在PCOS組明顯低于正常組。在動物實驗方面:最近研究發(fā)現在綿羊卵巢組織玻璃化冷凍過程中,AQP9對維持卵泡細胞內外的穩(wěn)態(tài)至關重要。有學者報道AQP3,8和9mRNA在小鼠成熟卵母細胞中表達;也有研究發(fā)現AQP9mRNA在大鼠卵母細胞成熟過程中逐漸消失。以上研究結果提示AQP9可能在卵母細胞成熟的過程中起重要作用。但是,AQP9在PCOS患者顆粒細胞和卵母細胞的表達及其與胰島素的相關性尚需研究進一步證實。綜上所述,深入研究AQP7和AQP9在PCOS患者卵泡發(fā)育中的作用及功能研究不僅有助于PCOS發(fā)病過程中的病理生理研究,也將為其臨床診治提供新的思路。目的:本研究采用Real-time qPCR和Western-Blot等分子生物學方法檢測PCOS組和對照組顆粒細胞中AQP7和AQP9的表達,探討其在各組顆粒細胞中的表達特點;通過檢測各時期卵母細胞中AQP7和AQP9的定位,探討其對卵母細胞發(fā)育成熟的影響;通過添加不同濃度胰島素及不同處理時間對體外培養(yǎng)正常人壁層顆粒細胞進行干預,探討胰島素對顆粒細胞中AQP7和AQP9表達的調控作用。方法:1.將收集到的各組卵巢組織做成病理切片,取出一部分行HE染色,鏡下觀察組織結構并拍照,比較各組卵巢結構特點;另一部分采用免疫組化法比較各組卵巢組織AQP7和AQP9分布情況及積分光密度值(integrated optical density,IOD)。2.分組:分為PCOS組和對照組。不同方法檢測各組壁層顆粒細胞和卵丘顆粒細胞中AQP7和AQP9表達水平。采用Real-time qPCR技術檢測各組AQP7和AQP9基因表達水平;采用Western-Blot技術檢測各組AQP7和AQP9蛋白的表達。3.采用免疫熒光技術檢測各時期卵母細胞中AQP7和AQP9的定位,探討其在卵母細胞發(fā)育過程的作用。4.體外培養(yǎng)正常人壁層顆粒細胞,分別添加不同濃度胰島素及不同處理時間進行干預,檢測干預后AQP7和AQP9基因及蛋白的表達變化,探討胰島素對顆粒細胞中AQP7和AQP9表達的調控。結果:1.AQP7蛋白及mRNA在PCOS組卵巢組織和各層顆粒細胞中的表達均明顯高于對照組(P0.05);AQP7蛋白定位于人類各時期卵母細胞的細胞漿和細胞膜上。2.AQP9在PCOS組卵巢組織中的表達顯著高于對照組(P0.05);而在PCOS組各層顆粒細胞中的表達顯著低于對照組(P0.05);AQP9蛋白定位于人類各時期卵母細胞的細胞漿和細胞膜上。3.隨著胰島素濃度的增加,與對照組相比,AQP7和AQP9 mRNA和蛋白的表達呈現下降趨勢。當胰島素濃度為100nmol/L時,其表達量下降最明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.100nmol/L胰島素作用于正常體外培養(yǎng)的顆粒細胞6~24h后,與對照組相比,AQP7和AQP9在12h表達量最低(P0.05)。結論:1.AQP7在PCOS患者卵巢組織和顆粒細胞中均高表達及在各期卵母細胞中表達,提示AQP7可能參與PCOS患者卵泡的生長發(fā)育過程。2.AQP9在PCOS患者卵巢組織中高表達而在顆粒細胞中低表達,且表達于各期卵母細胞中,提示AQP9可能參與PCOS患者卵泡的生長發(fā)育過程。3.AQP7和AQP9表達與胰島素呈濃度負相關;100nmol/L胰島素作用12h AQP7和AQP9表達量最低,提示胰島素可能通過調控AQP7和AQP9的表達影響卵泡的發(fā)育。
[Abstract]:The pathogenesis of polycystic ovary syndrome ( PCOS ) is 5 % 锝，

本文編號：1519590