本文關鍵詞： 卵巢癌 let-7i 順鉑 生物信息 靶基因　出處：《武漢大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的:卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的疾病,因卵巢癌死亡的人數在女性因癌癥死亡人數中居第五位,嚴重威脅著女性的生命和健康。卵巢癌的早期癥狀不明顯,大部分的患者在確診時已發(fā)展到腫瘤的晚期。目前,臨床上針對卵巢癌的主要治療手段是手術輔以化學藥物治療的聯(lián)合治療,但是70%以上的患者最終發(fā)展為化療藥物耐藥導致治療失敗,導致卵巢癌晚期患者的5年生存率低于30%。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼小RNA,通過與靶基因mRNA的結合,抑制靶基因翻譯。let-7i作為miRNA家族重要一員,已被發(fā)現(xiàn)參與到多種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉移與耐藥等過程中。本研究在分析let-7i在卵巢癌不同細胞中表達水平的基礎上,通過在卵巢癌細胞中過表達let-7i,探討其對細胞增殖、遷移侵襲以及順鉑敏感性等細胞生物學行為的影響;進一步對let-7i的靶基因進行預測、驗證,并運用數據挖掘方法鑒定卵巢癌中的關鍵基因,以研究let-7i在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制。方法:1.培養(yǎng)人永生化卵巢上皮細胞IOSE、卵巢癌SKOV3及其耐藥細胞株SKOV3/DDP細胞,A2780細胞,并采用濃度遞增法結合大劑量沖擊法誘導建立A2780/DDP細胞。采用實時熒光定量PCR方法檢測let-7i在上述細胞中的表達。2.利用脂質體轉染法將 let-7i mimics、let-7i mimics control、let-7i inhibitor、let-7i inhibitor control分別轉染細胞,采用實時熒光定量PCR方法檢測轉染效率。CCK-8實驗與EdU實驗檢測let-7i對卵巢癌SKOV3和A2780細胞增殖的影響,Transwell實驗檢測let-7i對卵巢癌SKOV3和A2780細胞遷移侵襲能力的影響,MTT實驗檢測let-7i對卵巢癌耐藥SKOV3/DDP與A2780/DDP細胞順鉑敏感性的影響。3.采用TargetScan、miRanda和PicTar三種miRNA靶基因預測軟件分析let-7i的靶基因,三種軟件所預測的基因交集作為候選靶基因,利用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Disco very)數據庫對靶基因集合進行 GO(Gene Ontology)分析以及基于 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的信號通路分析,發(fā)現(xiàn)潛在的信號通路和關鍵調節(jié)基因。4.采用雙熒光報告基因實驗與western blot實驗驗證let-7i的靶基因和信號通路的影響,采用OvMark在線數據庫進行靶基因表達的預后分析。5.利用GE02R鑒定三個卵巢癌mRNA表達芯片 GSE36668、GSE18520、GSE14407 中的差異表達基因(Differentially Expressed Gene,DEG),應用 STRING 構建 PPI(Protein-Protein Interaction)網絡。利用 GE02R鑒定卵巢癌miRNA表達芯片GSE47841中的差異表達miRNA,應用miRecords軟件預測miRNA的靶基因。篩選PPI網絡中的核心基因,利用Kaplan-Meierplotter進行基因表達與卵巢癌患者生存聯(lián)系的分析。結果:1.成功構建A2780/DDP卵巢癌耐藥細胞;實時熒光定量PCR結果顯示:與IOSE細胞相比,let-7i在SKOV3細胞與A2780細胞中表達顯著下調(P0.01);let-7i在耐藥細胞中表達顯著下調(P0.01)。2.let-7i mimics轉染細胞后,let-7i的表達水平顯著升高(P0.01)。let-7i過表達后,CCK-8與MTT實驗結果顯示,SKOV3細胞與A2780細胞的增殖能力降低(P0.05),SKOV3/DDP細胞的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)由 19.06lμmol/L 下降至15.52lnmol/L,A2780/DDP 細胞的 IC50 由 13.3Oμmol/L 下降至 8.33nmol/L;Transwell實驗結果顯示,SKOV3細胞與A2780細胞的遷移能力降低(P0.05),SKOV3細胞的侵襲能力降低(PO.O5)。3.TargetScan、miRanda和PicTar三種軟件預測得到324個let-7i的潛在靶基因,應用DAVID數據庫分析顯示,let-7i靶基因顯著富集于絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)信號通路(P0.05),其中包括TAB2等潛在靶基因。4.雙熒光報告基因實驗與western blot實驗顯示,let-7i過表達后,帶有TAB2 3'UTR片段的報告質粒熒光強度明顯下降(P0.05),SKOV3細胞與A2780細胞中TLR4與TAB2蛋白的表達降低(P0.05),而且let-7i能降低SKOV3細胞與A2780細胞中P38 MAPK途徑的磷酸化水平(P0.05)。OvMark數據庫分析顯示,高表達的TAB2是影響卵巢癌患者生存時間的危險因素,總生存期與無病生存期明顯降低(PO.O5)。5.GSE36668、GSE18520、GSE14407三種mRNA表達芯片中篩選得到345個異常表達基因。PPI網絡共包含141個差異表達基因,其中16個核心基因,KM plotter分析結果顯示,共有四個基因的高表達是卵巢癌生存時間的危險因素:CCNB1(HR 1.26,P=0.04),CENPF(HR 1.18,P = 0.014),KIF11(HR 1.15,P = 0.04),ZWINT(HR 1.15,P= 0.04)O結論:let-7i在卵巢癌細胞中表達下調,let-7i過表達可以抑制卵巢癌SKOV3細胞與A2780細胞的生長、遷移和侵襲能力,能夠逆轉順鉑耐藥細胞SKOV3/DDP與A2780/DDP的耐藥性。let-7i發(fā)揮上述抑制作用可能是通過下調其靶基因TAB2與TLR4的表達,抑制P38的磷酸化而實現(xiàn)。此外,通過數據庫分析提示,CCNB1、CENPF、KIF11、ZWINT四種基因在卵巢癌中表達上調,并對卵巢癌預后的預測具有指導意義。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : Ovarian cancer is the most common disease in ovarian cancer . The number of patients with ovarian cancer is the fifth in ovarian cancer . The effect of let - 7i on ovarian cancer cell proliferation , migration and resistance of ovarian cancer cells is investigated by means of real - time fluorescence quantitative PCR . Using GE02R to identify the target gene of ovarian cancer miRNA expression chip GSE47841 , the IC50 of let - 7i was decreased to 15.52lnmol / L . The IC50 of the cells was decreased from 13.3O 渭mol / L to 8.33 nmol / L . The results showed that the high expression of TAB2 was a risk factor affecting the survival time of ovarian cancer . The expression of KIF11 and ZWINT genes is up - regulated in ovarian cancer and has a guiding significance for predicting the prognosis of ovarian cancer .

【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Establishment of hepatocellular carcinoma multidrug resistant monoclone cell line HepG2/mdr1[J];Chinese Medical Journal;2007年08期

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本文編號：1514006