發(fā)布時間：2018-02-15 22:18

  本文關(guān)鍵詞： 卵巢癌 let-7i 順鉑 生物信息 靶基因　出處：《武漢大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的:卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的疾病,因卵巢癌死亡的人數(shù)在女性因癌癥死亡人數(shù)中居第五位,嚴(yán)重威脅著女性的生命和健康。卵巢癌的早期癥狀不明顯,大部分的患者在確診時已發(fā)展到腫瘤的晚期。目前,臨床上針對卵巢癌的主要治療手段是手術(shù)輔以化學(xué)藥物治療的聯(lián)合治療,但是70%以上的患者最終發(fā)展為化療藥物耐藥導(dǎo)致治療失敗,導(dǎo)致卵巢癌晚期患者的5年生存率低于30%。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼小RNA,通過與靶基因mRNA的結(jié)合,抑制靶基因翻譯。let-7i作為miRNA家族重要一員,已被發(fā)現(xiàn)參與到多種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移與耐藥等過程中。本研究在分析let-7i在卵巢癌不同細(xì)胞中表達(dá)水平的基礎(chǔ)上,通過在卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)let-7i,探討其對細(xì)胞增殖、遷移侵襲以及順鉑敏感性等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;進(jìn)一步對let-7i的靶基因進(jìn)行預(yù)測、驗證,并運用數(shù)據(jù)挖掘方法鑒定卵巢癌中的關(guān)鍵基因,以研究let-7i在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制。方法:1.培養(yǎng)人永生化卵巢上皮細(xì)胞IOSE、卵巢癌SKOV3及其耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP細(xì)胞,A2780細(xì)胞,并采用濃度遞增法結(jié)合大劑量沖擊法誘導(dǎo)建立A2780/DDP細(xì)胞。采用實時熒光定量PCR方法檢測let-7i在上述細(xì)胞中的表達(dá)。2.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 let-7i mimics、let-7i mimics control、let-7i inhibitor、let-7i inhibitor control分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,采用實時熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率。CCK-8實驗與EdU實驗檢測let-7i對卵巢癌SKOV3和A2780細(xì)胞增殖的影響,Transwell實驗檢測let-7i對卵巢癌SKOV3和A2780細(xì)胞遷移侵襲能力的影響,MTT實驗檢測let-7i對卵巢癌耐藥SKOV3/DDP與A2780/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響。3.采用TargetScan、miRanda和PicTar三種miRNA靶基因預(yù)測軟件分析let-7i的靶基因,三種軟件所預(yù)測的基因交集作為候選靶基因,利用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Disco very)數(shù)據(jù)庫對靶基因集合進(jìn)行 GO(Gene Ontology)分析以及基于 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的信號通路分析,發(fā)現(xiàn)潛在的信號通路和關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。4.采用雙熒光報告基因?qū)嶒炁cwestern blot實驗驗證let-7i的靶基因和信號通路的影響,采用OvMark在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因表達(dá)的預(yù)后分析。5.利用GE02R鑒定三個卵巢癌mRNA表達(dá)芯片 GSE36668、GSE18520、GSE14407 中的差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Gene,DEG),應(yīng)用 STRING 構(gòu)建 PPI(Protein-Protein Interaction)網(wǎng)絡(luò)。利用 GE02R鑒定卵巢癌miRNA表達(dá)芯片GSE47841中的差異表達(dá)miRNA,應(yīng)用miRecords軟件預(yù)測miRNA的靶基因。篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因,利用Kaplan-Meierplotter進(jìn)行基因表達(dá)與卵巢癌患者生存聯(lián)系的分析。結(jié)果:1.成功構(gòu)建A2780/DDP卵巢癌耐藥細(xì)胞;實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:與IOSE細(xì)胞相比,let-7i在SKOV3細(xì)胞與A2780細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01);let-7i在耐藥細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01)。2.let-7i mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,let-7i的表達(dá)水平顯著升高(P0.01)。let-7i過表達(dá)后,CCK-8與MTT實驗結(jié)果顯示,SKOV3細(xì)胞與A2780細(xì)胞的增殖能力降低(P0.05),SKOV3/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)由 19.06lμmol/L 下降至15.52lnmol/L,A2780/DDP 細(xì)胞的 IC50 由 13.3Oμmol/L 下降至 8.33nmol/L;Transwell實驗結(jié)果顯示,SKOV3細(xì)胞與A2780細(xì)胞的遷移能力降低(P0.05),SKOV3細(xì)胞的侵襲能力降低(PO.O5)。3.TargetScan、miRanda和PicTar三種軟件預(yù)測得到324個let-7i的潛在靶基因,應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫分析顯示,let-7i靶基因顯著富集于絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)信號通路(P0.05),其中包括TAB2等潛在靶基因。4.雙熒光報告基因?qū)嶒炁cwestern blot實驗顯示,let-7i過表達(dá)后,帶有TAB2 3'UTR片段的報告質(zhì)粒熒光強(qiáng)度明顯下降(P0.05),SKOV3細(xì)胞與A2780細(xì)胞中TLR4與TAB2蛋白的表達(dá)降低(P0.05),而且let-7i能降低SKOV3細(xì)胞與A2780細(xì)胞中P38 MAPK途徑的磷酸化水平(P0.05)。OvMark數(shù)據(jù)庫分析顯示,高表達(dá)的TAB2是影響卵巢癌患者生存時間的危險因素,總生存期與無病生存期明顯降低(PO.O5)。5.GSE36668、GSE18520、GSE14407三種mRNA表達(dá)芯片中篩選得到345個異常表達(dá)基因。PPI網(wǎng)絡(luò)共包含141個差異表達(dá)基因,其中16個核心基因,KM plotter分析結(jié)果顯示,共有四個基因的高表達(dá)是卵巢癌生存時間的危險因素:CCNB1(HR 1.26,P=0.04),CENPF(HR 1.18,P = 0.014),KIF11(HR 1.15,P = 0.04),ZWINT(HR 1.15,P= 0.04)O結(jié)論:let-7i在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),let-7i過表達(dá)可以抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞與A2780細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力,能夠逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP與A2780/DDP的耐藥性。let-7i發(fā)揮上述抑制作用可能是通過下調(diào)其靶基因TAB2與TLR4的表達(dá),抑制P38的磷酸化而實現(xiàn)。此外,通過數(shù)據(jù)庫分析提示,CCNB1、CENPF、KIF11、ZWINT四種基因在卵巢癌中表達(dá)上調(diào),并對卵巢癌預(yù)后的預(yù)測具有指導(dǎo)意義。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : Ovarian cancer is the most common disease in ovarian cancer . The number of patients with ovarian cancer is the fifth in ovarian cancer . The effect of let - 7i on ovarian cancer cell proliferation , migration and resistance of ovarian cancer cells is investigated by means of real - time fluorescence quantitative PCR . Using GE02R to identify the target gene of ovarian cancer miRNA expression chip GSE47841 , the IC50 of let - 7i was decreased to 15.52lnmol / L . The IC50 of the cells was decreased from 13.3O 渭mol / L to 8.33 nmol / L . The results showed that the high expression of TAB2 was a risk factor affecting the survival time of ovarian cancer . The expression of KIF11 and ZWINT genes is up - regulated in ovarian cancer and has a guiding significance for predicting the prognosis of ovarian cancer .

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Establishment of hepatocellular carcinoma multidrug resistant monoclone cell line HepG2/mdr1[J];Chinese Medical Journal;2007年08期

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本文編號：1514006