發(fā)布時間：2018-02-14 21:35

  本文關鍵詞： 宮頸癌 組蛋白脫乙酰化酶抑制劑 ATRA ChIP 分化治療　出處：《山東大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：宮頸癌最常見的女性生殖道惡性腫瘤,發(fā)病率和病死率居生殖道惡性腫瘤首位。每年全世界大約有53萬新發(fā)病例,約50%患者死于該疾病,其中的80%來自發(fā)展中國家。早期宮頸癌一般推薦采用手術治療,對于晚期轉移和復發(fā)的病例,則失去了手術機會,常規(guī)采用化療和放療。然而,由于耐藥的發(fā)生,患者身體耐受狀況的惡化,放、化療效果十分有限。因此,深入探討宮頸癌發(fā)病機制,尋找更為安全有效、靶向性強的宮頸癌防治辦法意義重大。 靶向抑制組蛋白脫乙�；�(histone deacetylase, HDAC)是一種目前非常有前景的腫瘤治療手段。組蛋白的乙�；揎検且环N重要的基因表達調(diào)控模式,由HDAC和組蛋白乙�；D移酶(histone acetyl-transferase, HAT)共同調(diào)節(jié)。研究證實,脫乙�；饔眠^度,導致一系列腫瘤抑制基因下調(diào)／沉默,在腫瘤的發(fā)生過程起到關鍵作用；在宮頸癌組織中,HDAC活性異常增高；宮頸脫落細胞學發(fā)現(xiàn)組蛋白H3乙�；脚c宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervival intraepithelial neoplasia, CIN)程度相關。因此,組蛋白脫乙�；敢种苿�(histone deacetylase inhibitor, HDACi)是一種潛在的宮頸癌靶向治療藥物。 全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是一種上皮細胞生長和分化的調(diào)節(jié)劑,可以誘導發(fā)生轉化的細胞重新進入分化程序,而被用于腫瘤的防治。ATRA與受體(retinoic acid receptor, RAR)結合,尤其是RARβ2,才能發(fā)揮抗腫瘤作用。RARβ2作為一種重要的腫瘤抑制基因,由于啟動子區(qū)域的甲基化和／或去乙酰化修飾而在包括宮頸癌在內(nèi)很多腫瘤中的表達被沉默。有研究報道,HDACi可以上調(diào)多種腫瘤RARβ2的表達。因此,HDACi聯(lián)合ATRA能否重啟宮頸細胞RARβ2的表達,并發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用值得深入研究。 本課題將分析臨床宮頸癌組織中組蛋白乙�；脚c腫瘤抑制基因(Tumor suppressor genes, TSGs)表達及相關病理參數(shù)的關系；深入探討HDACi (VPA和SAHA)聯(lián)合ATRA對宮頸癌細胞RARβ2的表達的影響,從表觀遺傳修飾角度來闡明調(diào)控機制；通過體外實驗,研究HDACi聯(lián)合ATRA的抗宮頸癌作用,并深入探討分子機制；建立人宮頸癌移植瘤模型,進一步評價療效和驗證分子機制。 主要研究結果如下： 1宮頸癌組織中組蛋白乙�；胶蚏ARβ2及其下游基因的表達顯著降低,甚至缺失：選取高、中、低分化的宮頸鱗癌組織65例,免疫組化檢測AcH3、RARβ2、 E-cadherin和β-catenin的表達并評分。結果顯示,隨著宮頸癌組織分化程度的降低,AcH3、RARβ2、E-cadherin和p-catenin的表達逐漸降低、甚至缺失；組蛋白H3的乙�；脚cRARβ2、E-cadherin和β-catenin的表達呈顯著的正相關性(r=0.560, r=0.731, and r=0.733, P均0.01)。表明,宮頸癌的進展過程中存在表觀遺傳修飾的異常,后者可能參與調(diào)控腫瘤抑制基因RARβ2. E-cadherin和β-catenin的表達。 2HDACi聯(lián)合ATRA顯著提高宮頸癌細胞株AcH3水平,重啟RARβ2表達：HDACi聯(lián)合ATRA處理宮頸癌細胞株HeLa和SiHa48h后,基因表達譜芯片和Q-PCR結果證實RARβ2表達重啟,轉錄水平顯著上調(diào),而RARα和RARγ則為組成性表達；WB顯示組蛋白乙�；斤@著提高,RARβ2表達量顯著上升。 3AcH3與RARβ2啟動子區(qū)域RARE結合,啟動RARβ2表達：以往研究證實,組蛋白H3第9位賴氨酸乙�；c基因轉錄活化相關。我們采用H3K9ac抗體進行ChIP實驗,結果顯示HDACi聯(lián)合ATRA通過提高H3K9ac水平,后者再與RARβ2啟動子區(qū)RARE結合,從而重啟RARβ2表達。 4HDACi聯(lián)合ATRA顯著抑制宮頸癌細胞增殖 1) HDACi聯(lián)合ATRA抑制宮頸癌細胞增殖能力： MTT實驗顯示,HDACi與ATRA聯(lián)合有效抑制宮頸癌細胞增殖,細胞增殖抑制率顯著高于VPA和ATRA單一應用(P0.01),甚至優(yōu)于1mgL順鉑對宮頸癌細胞的抑制作用(P0.01)；ATRA對pIRES2-RARβ2-EGFP穩(wěn)轉宮頸癌細胞株的抑制作用與聯(lián)合用藥效果無顯著差異(P0.05),表明HDACi重啟宮頸癌細胞RARβ2表達,提供了與ATRA協(xié)同抗腫瘤作用的分子基礎。藥物處理后,Ki67的表達明顯減少,細胞集落形成能力被顯著抑制,聯(lián)合用藥效果優(yōu)于任一藥物單用(P0.01),再次驗證了HDACi和ATRA的協(xié)同／相加抑制宮頸癌細胞增殖的作用。 2) HDACi聯(lián)合ATRA引起宮頸癌細胞G1期阻滯：HDACi和ATRA處理宮頸癌細胞株48h后檢測細胞周期,結果顯示聯(lián)合用藥使細胞株發(fā)生G1期阻滯；WB結果表明,HDACi和ATRA顯著上調(diào)P21CIP1和P53的表達,而p-Stat3水平顯著降低,Cyclin D1水平僅輕微下調(diào)。 3) HDACi聯(lián)合ATRA誘導宮頸癌細胞分化：細胞進入分化程序前需脫離細胞周期,WB和免疫組化結果證實,HDACi聯(lián)合ATRA顯著提高上皮細胞分化標志物Filaggrin、Loricrin、和Involucrin的表達；FACS和WB結果顯示,藥物處理后未引起細胞凋亡的顯著增加。 4) HDACi聯(lián)合ATRA通過E-cadherin/PI3K/Akt通路誘導細胞分化：WB顯示藥物聯(lián)合處理上調(diào)E-cadherin/β-catenin和p-Akt水平；分別采用LE-135拮抗RARβ2、siRNA沉默E-cadherin、LY-294002抑制PI3K活性、和siRNA沉默Akt1/2表達,可以阻斷誘導分化作用。表明,HDACi聯(lián)合ATRA重啟RARβ2表達,通過E-cadherin-PI3K/Akt通路誘導宮頸癌細胞分化。 5HDACi聯(lián)合ATRA抑制裸鼠皮下移植瘤的生長：分別將5×106HeLa和SiHa細胞裸鼠背部皮下注射,建立移植瘤模型。治療4周后,聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤生長,腫瘤體積顯著小于VPA組和ATRA組(P0.01),與順鉑治療組無顯著差異(P0.05)。與體外實驗結果一致,WB顯示藥物聯(lián)合處理顯著提高組蛋白乙�；�,重啟宮頸癌細胞RARβ2并上調(diào)P21CIP1和P53的表達,而Stat3磷酸化水平顯著降低。免疫組化顯示,聯(lián)合藥物處理抑制Ki67表達,增強上皮細胞終末分化標志Filaggrin、Loricrin、和Involucrin的表達。 6建立人宮頸癌組織裸鼠皮下移植瘤模型,驗證HDACi聯(lián)合ATRA對宮頸癌的治療作用 1) HDACi聯(lián)合ATRA抑制人宮頸癌組織移植瘤的生長：收集人低分化宮頸鱗癌組織,經(jīng)過裸鼠皮下2次移植建立移植瘤模型。藥物治療4周后,聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤生長(P0.01),對照組、VPA組、ATRA組和聯(lián)合用藥組腫瘤平均體積分別316.65±94.58mm3,119.83±7.74mm3, and208.64±76.61mm3,66.84±19.10mm3；腫瘤抑制率(percentage of tumor-growth inhibition,%TGI)分別為59.39%,37.58%,和73.33%。 2) HDACi聯(lián)合ATRA誘導移植瘤分化及細胞凋亡：藥物治療4周后,剝離腫瘤組織,HE染色可見聯(lián)合治療組出現(xiàn)細胞角化和少量角化珠形成,未見核分裂相,而對照組仍維持來源宮頸癌組織的低分化狀態(tài),核分裂相多見。免疫組化顯示,HDACi聯(lián)合ATRA抑制Ki67表達,提高AcH3、RARβ2、及Loricrin、和Involucrin的表達；TUNEL檢測顯示,VPA治療后凋亡細胞增加,聯(lián)合治療組凋亡細胞增加最為顯著(P0.01)。 3) HDACi聯(lián)合ATRA通過表觀遺傳調(diào)控機制重啟RARβ2而發(fā)揮抗腫瘤作用：藥物治療4周后,免疫組化和WB結果表明組蛋白H3乙�；斤@著提高；ChIP結果顯示,H3K9ac可以與RARβ2啟動子核心區(qū)域RARE結合,從而啟動RARβ2的表達；與體外實驗結果一致,Q-PCR和WB結果顯示重啟RARβ2表達后,其下游E-cadherin和上皮細胞分化標志物Involucrin和Loricrin的表達顯著上調(diào)；同時P21CIP1、P53和活化的Caspase3表達上調(diào),Stat3磷酸化水平顯著降低,Bcl2的表達出現(xiàn)下調(diào)。 綜上所述,HDACi單獨和聯(lián)合ATRA可以通過表觀遺傳途徑重啟宮頸癌細胞RARβ2的表達,繼而提供了兩者協(xié)同／相加抗腫瘤作用的分子基礎；HDACi聯(lián)合ATRA使宮頸癌細胞脫離細胞周期,通過E-cadherin/PI3K/Akt通路誘導細胞分化是其抗腫瘤作用的主要機制,細胞凋亡也發(fā)揮了一定作用。本研究不僅進一步完善了宮頸癌的發(fā)病機制,而且闡明了HDACi聯(lián)合ATRA對宮頸癌誘導分化治療的效果及信號途徑,為臨床宮頸癌的防治提供了新的策略,但是治療效果還需要通過臨床試驗進一步驗證和評價。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

【共引文獻】

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本文編號：1511668