本文關(guān)鍵詞： 人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞 硫化氫 前列腺素 E2合成酶 siRNA　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：臨床上將在圍著床期時(shí)發(fā)生的早期妊娠丟失稱為生化妊娠，這種現(xiàn)象在人類中相對(duì)普遍。盡管體外輔助生殖技術(shù)得到迅速發(fā)展，許多潛在不孕原因得到克服，但其受孕率仍較低，其主要原因是胚胎植入失敗。而子宮內(nèi)膜容受性是影響胚胎植入的關(guān)鍵因素之一，子宮內(nèi)膜容受過(guò)程實(shí)際就是一個(gè)促炎性反應(yīng)及子宮內(nèi)膜血管的通透性增加的過(guò)程。在這過(guò)程中受到雌孕激素以及各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、粘附分子等組成一個(gè)精細(xì)的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)共同調(diào)控，在這系統(tǒng)調(diào)控下子宮內(nèi)膜才能達(dá)到對(duì)胚泡最大容受性，目前已有研究證實(shí)前列腺素是提高子宮內(nèi)膜血管通透性的重要介質(zhì)，并有研究發(fā)現(xiàn)如體內(nèi)缺乏一些前列腺素合成酶可導(dǎo)致著床及子宮內(nèi)膜蛻膜化失敗。另外有文獻(xiàn)報(bào)道在一些炎性疾病中細(xì)胞所產(chǎn)生的內(nèi)源性H2S可上調(diào)環(huán)氧化酶-2（COX2）的表達(dá)。而H2S作為一種新型信號(hào)氣體分子，研究者發(fā)現(xiàn)其可參與體內(nèi)許多系統(tǒng)的生理、病理機(jī)制,比如：H2S可通過(guò)激活血管平滑肌細(xì)胞鉀離子通道（KATP）使細(xì)胞內(nèi)膜超極化，達(dá)到擴(kuò)張血管平滑肌作用，從而控制血壓。而在生殖系統(tǒng)方面，2009年P(guān)atel等人首次在大鼠和人類的子宮肌、胎盤(pán)、胎膜中發(fā)現(xiàn)有胱硫醚 β 合酶（CBS）和胱硫醚 γ 裂解酶（CSE）的表達(dá)，可產(chǎn)生內(nèi)源性H2S，隨后研究發(fā)現(xiàn)H2S在妊娠期間維持子宮靜止?fàn)顟B(tài)起到一定作用。但目前人子宮內(nèi)膜是否同樣有CBS和CSE的表達(dá)，且具有產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的能力，參與其生理、病理機(jī)制的調(diào)節(jié)，這方面尚無(wú)報(bào)道。為此，本課題以原代培養(yǎng)的人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，首先確認(rèn)原代培養(yǎng)的人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中含有CBS、CSE的表達(dá)，提示人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可能具有產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的能力。隨后加入外源性的雌孕激素對(duì)細(xì)胞處理，明確人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中CBS、CSE的表達(dá)受性激素調(diào)節(jié)。另外，通過(guò)對(duì)原代培養(yǎng)的人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中加入H2S供體-NaHS、前體L-cys，明確了H2S對(duì)COX2、mPGES-1表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。并利用siRNA干擾技術(shù)，進(jìn)一步明確在人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中內(nèi)源性H2S生成的關(guān)鍵酶。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、原代培養(yǎng)人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中CBS和CSE的表達(dá)情況 為說(shuō)明原代培養(yǎng)的人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是否有內(nèi)源性H2S的能力，我們首先利用免疫組化方法證實(shí)在人正常子宮內(nèi)膜中含有CBS、CSE的表達(dá)，而后進(jìn)一步培養(yǎng)原代人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，利用Western blot方法顯示細(xì)胞中同樣有CBS、CSE的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可能具有產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的能力；同時(shí)為了解人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生是否受性激素影響，我們加入外源性雌二醇及孕激素，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)CBS和CSE的表達(dá)，提示在雌二醇及孕激素均上調(diào)細(xì)胞中CBS和CSE的蛋白表達(dá)，且雌孕激素聯(lián)合給藥時(shí)更為顯著。根據(jù)以上結(jié)果作出以下推論：在人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中可能有內(nèi)源性H2S產(chǎn)生，且可能在分泌期時(shí)較高。 2、H2S調(diào)節(jié)原代人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞前列腺素E2合成酶的表達(dá) 為明確H2S如何調(diào)控原代培養(yǎng)的人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中COX2、mPGES-1的表達(dá)。 首先，加入不同濃度的H2S的供體NaHS和前體L-半胱氨酸，然后通過(guò)Western blot方法檢測(cè)前列腺素E2合成酶-COX2和mPGES-1的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果提示：H2S對(duì)原代培養(yǎng)的人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中前列腺素E2合成酶-COX2和mPGES-1的蛋白表達(dá)起上調(diào)作用，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依耐性；接下來(lái)，為進(jìn)一步確定CBS、CSE在L-cys在調(diào)節(jié)細(xì)胞中COX2、mPGES-1表達(dá)的作用，我們?cè)谠囵B(yǎng)的人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中加入CBS siRNA和CSE siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，加入L-cys，Western blot方法檢測(cè)前列腺素E2合成酶-COX2和mPGES-1的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中COX2、mPGES-1的蛋白表達(dá)均下降。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推論：H2S在人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中通過(guò)上調(diào)前列腺素E2合成酶-COX2和mPGES-1的蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)PGE2生成的上調(diào)作用。另外，為證實(shí)H2S在人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中通過(guò)KATP通道來(lái)調(diào)節(jié)COX2、mPGES-1的表達(dá)，我們加入KATP拮抗劑-格列本脲，，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：格列本脲可逆轉(zhuǎn)H2S對(duì)細(xì)胞中COX2、mPGES-1表達(dá)的上調(diào)。 結(jié)論： 人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞受CBS和CSE共同作用下產(chǎn)生內(nèi)源性H2S，且可能受體內(nèi)雌二醇及孕激素調(diào)控產(chǎn)生變化。H2S可通過(guò)原代人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞KATP通道來(lái)上調(diào)COX2、mPGES-1的表達(dá)，從而增加人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞局部的PGE2濃度，進(jìn)而參與到子宮內(nèi)膜容受性和基質(zhì)蛻膜化調(diào)節(jié)。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R714.8

【共引文獻(xiàn)】

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1 楊玲玲;邵琿;原鵬波;郭曉s

本文編號(hào)：1462489