本文關(guān)鍵詞： 卵巢癌 白藜蘆醇 細胞凋亡 Notch信號通路 Wnt信號通路 STAT3信號通路 c-Myc surviving Bcl-2 L-685 458 XAV-939 AG490　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的卵巢癌(Ovarian Cancer,OC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,全世界范圍內(nèi)每年平均大約有超過200,000名婦女被確診為卵巢癌患者,死亡人數(shù)達120,000之多,其病死率居于婦科腫瘤的首位,嚴(yán)重威脅女性的生命健康。由于卵巢惡性腫瘤位于盆腔深處,所以多數(shù)患者早期癥狀不明顯,確診時約75%的患者已屬于晚期,且已發(fā)生了腹腔轉(zhuǎn)移。目前,采用卵巢惡性腫瘤細胞減滅術(shù)并輔以紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物進行化療是國內(nèi)外公認治療卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)方案。近年來,卵巢癌病理分期的進一步精確以及外科手術(shù)技術(shù)的進步使卵巢癌的臨床療效有所提升,但其5年生存率仍不樂觀,大多數(shù)患者死于復(fù)發(fā)耐藥。另外,以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療藥物,在殺傷腫瘤細胞的同時也損傷了腫瘤周圍正常的組織和器官,其毒副作用給患者帶來了無法承受的痛苦,以致于難以繼續(xù)下一療程。因此,尋求更為有效且無明顯毒副作用的抗卵巢癌藥物,探索其作用的分子機制具有重要的學(xué)術(shù)價值和現(xiàn)實的臨床意義。白藜蘆醇(resveratrol,RV or Res)是一種天然的多酚類化合物,廣泛存在于虎杖、葡萄、桑葚、花生等植物中。研究證明,白藜蘆醇具抗心血管疾病、抗突變、抗炎、抗氧化、延緩衰老、防治腫瘤、誘導(dǎo)細胞凋亡及保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)等廣泛的生物藥理學(xué)活性。而且,越來越多的實驗證明,白藜蘆醇能夠在膀胱癌、乳腺癌、髓母細胞瘤等多種惡性腫瘤中發(fā)揮其抗腫瘤的獨特作用。更為重要的是,迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對機體和正常細胞有明顯的毒副作用。由此可見,白藜蘆醇在腫瘤治療方面具有較高的藥用價值。目前的研究數(shù)據(jù)也顯示,白藜蘆醇通過多種途徑,發(fā)揮其預(yù)防和抗腫瘤的作用,如白藜蘆醇能使髓母細胞瘤細胞阻滯在s期并明顯下調(diào)c-myc、cyclinb和cyclind1表達,從而抑制細胞生長誘導(dǎo)其凋亡;它能上調(diào)cyp1a1和下調(diào)cyp1b1表達,引起wnt、notch、stat3等信號通路的活化狀態(tài)以及他們下游靶基因表達形式的改變。目前,關(guān)于白藜蘆醇在卵巢癌中的作用也有報道。然而,有關(guān)白藜蘆醇抗卵巢癌作用的具體分子機理尚未明確,仍是研究的一大熱點。卵巢惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,且其對腫瘤細胞的增殖和存活具有重要的作用。例如,極度活躍的jak/stat3信號通路能夠促進卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移。同樣有研究顯示,wnt信號通路在卵巢癌細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用,而抑制與卵巢癌細胞相關(guān)的notch信號通路,可以增強卵巢癌細胞對鉑類藥物的敏感性。亦有資料顯示,阻斷notch、wnt和stat3信號通路可以抑制多種惡性腫瘤的增殖能力。鑒于以上原因,本實驗選擇了兩個人卵巢癌細胞系,從多角度研究白藜蘆醇抗卵巢癌作用的分子機制,明確其作用的主要分子靶點及其抗腫瘤生物學(xué)意義,以期能為白藜蘆醇在卵巢癌臨床治療中的應(yīng)用提供科學(xué)而可靠的理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容包括:(1)探討白藜蘆醇對人卵巢癌細胞的影響,比較不同的人卵巢癌細胞系對白藜蘆醇的敏感程度、時間劑量相關(guān)性以及對細胞的殺傷性質(zhì);(2)分析白藜蘆醇處理前后,人卵巢癌細胞中notch、wnt、stat3三條信號通路的活化狀態(tài)的改變,進一步觀察相關(guān)信號通路下游靶基因的表達情況的變化。(3)分析三個信號通路的特異性抑制劑對兩個細胞系的作用特點,進一步探討白藜蘆醇對卵巢癌作用的關(guān)鍵分子靶點材料與方法選取兩個人卵巢癌細胞系caov-3和ovcar-3,分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中,和12%胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中。將兩種人卵巢癌細胞系caov-3和ovcar-3長時間暴露于100μm和120μm白藜蘆醇中,每12小時顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)的變化,連續(xù)觀察72小時;通過mtt、tunel染色、he染色、臺盼藍計數(shù)及流式細胞儀等方法對白藜蘆醇的抗卵巢癌作用進行檢測,分析不同培養(yǎng)條件下兩種人卵巢癌細胞系對白藜蘆醇的敏感程度的變化以及二者對白藜蘆醇敏感程度的差異性;采用免疫細胞化學(xué)(icc),rt-pcr及western蛋白印跡分析等方法從分子水平檢測兩種人卵巢癌細胞系經(jīng)白藜蘆醇處理前后,notch、wnt、stat3三條信號通路活化狀態(tài)的改變,分析探討下游相關(guān)靶基因survivin、c-myc、bcl-2的表達特點。隨后,選擇notch、wnt、stat3三條通路的特異性抑制劑l-685,458、xav-939、ag490分別處理兩種人卵巢癌細胞系caov-3和ovcar-3,采用he染色、mtt及臺盼藍細胞計數(shù)等方法檢測分析在不同處理條件下,兩種人卵巢癌細胞增殖活性的變化,通過免疫細胞化學(xué)(icc)分析方法對信號通路中關(guān)鍵分子的檢測,探討三個抑制劑對信號通路的改變情況。實驗數(shù)據(jù)采用spss17.0軟件包應(yīng)用獨立樣本的t檢驗和單因素方差檢驗方法進行分析。結(jié)果1.白藜蘆醇可有效地抑制卵巢癌細胞的生長,誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡mtt分析和活細胞計數(shù)結(jié)果顯示,白藜蘆醇以時間劑量相關(guān)性方式抑制卵巢癌caov-3細胞和ovcar-3細胞的增殖。同時,h/e染色和tunel分析的結(jié)果顯示,120μm白藜蘆醇處理48小時后,這兩個卵巢癌細胞系中均存在一定數(shù)量的凋亡細胞。另外,流式細胞儀檢測的結(jié)果也顯示,120μm白藜蘆醇可以引起卵巢癌細胞發(fā)生明顯的g1期阻滯。2.白藜蘆醇對卵巢癌細胞系中notch、wnt及stat3三條信號通路的作用(1)白藜蘆醇對卵巢癌細胞系中notch通路的影響免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,在兩個卵巢癌細胞系中,notch1、notch2及其下游基因hes1均呈陽性表達,主要存在于胞漿中。經(jīng)120μm白藜蘆醇處理48小時后,notch2和hes1在兩個卵巢癌細胞系中的表達均有所下降;notch1在后者中表達降低,但是在前者的表達略有升高。westernblotting與rt-pcr的結(jié)果,與免疫細胞化學(xué)結(jié)果相一致。(2)白藜蘆醇對卵巢癌細胞系中wnt通路的影響免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,在兩個卵巢癌細胞系中,wnt2在細胞質(zhì)中均呈陽性表達。在caov-3細胞中的β-catenin呈陽性表達,分布于細胞質(zhì)和細胞核中;而在ovcar-3細胞中僅在細胞質(zhì)中存在呈陽性表達的β-catenin。經(jīng)120μm白藜蘆醇處理48小時后,wnt2在caov-3細胞中的表達顯著下降,在ovcar-3細胞中略有升高。β-catenin表達下降且出現(xiàn)膜易位現(xiàn)象。e-cadherin在ovcar-3表達增強主要分布于細胞膜上。westernblotting與rt-pcr的結(jié)果與免疫細胞化學(xué)結(jié)果相一致。(3)白藜蘆醇對卵巢癌細胞系中stat3通路的影響免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,在兩個卵巢癌細胞系中stat3以及p-stat3均呈陽性表達,分布于細胞質(zhì)和細胞核中。經(jīng)120μm白藜蘆醇處理48小時后,胞漿和胞質(zhì)中的stat3以及p-stat3表達均下調(diào),且胞核中p-stat3的表達幾乎轉(zhuǎn)為陰性,即無顯著的核易位現(xiàn)象。westernblotting與rt-pcr的結(jié)果與免疫細胞化學(xué)結(jié)果相一致。2.白藜蘆醇對兩個卵巢癌系中notch、wnt及stat3三條信號通路下游基因survivin、c-myc和bcl-2的作用通過icc、westernblotting及rt-pcr等方法對notch、wnt及stat3三條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶基因survivin、c-myc和bcl-2進行檢測,結(jié)果為這兩個人卵巢癌細胞系經(jīng)120μm白藜蘆醇處理48h后,survivin、c-myc和bcl-2的表達水平均有不同程度的下降。westernblotting與rt-pcr的結(jié)果與免疫細胞化學(xué)結(jié)果相一致。3.卵巢癌細胞系caov-3和ovcar-3對三條信號通路特異性抑制劑的敏感性。(1)notch信號通路的特異性抑制劑l-685,458對卵巢癌caov-3細胞和ovcar-3細胞的生長均無影響he染色和mtt結(jié)果均顯示,8μm的l-685,458處理前后,無論是caov-3細胞還是ovcar-3細胞的細胞形態(tài)數(shù)量均沒有明顯改變,這種抑制劑不能誘導(dǎo)卵巢癌細胞產(chǎn)生凋亡。(2)wnt信號通路的抑制劑xav939對卵巢癌caov-3細胞和ovcar-3細胞的生長均無影響he染色和mtt結(jié)果均顯示,10μm的xav939處理前后,無論是caov-3細胞還是ovcar-3細胞的細胞形態(tài)數(shù)量均沒有明顯改變,這種抑制劑不能誘導(dǎo)卵巢癌細胞產(chǎn)生凋亡。(3)stat3信號通路的特異性抑制劑ag490能夠抑制卵巢癌caov-3細胞和ovcar-3細胞中p-stat3的表達,從而誘導(dǎo)這兩個人卵巢癌細胞系發(fā)生凋亡,抑制癌細胞增值。免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,經(jīng)80μM的AG490處理48小時,兩個卵巢癌細胞系中p-STAT3的表達均顯著降低,且在細胞核中的表達轉(zhuǎn)為陰性。其對卵巢癌細胞的抑制效果類似于白藜蘆醇,白藜蘆醇和AG490對卵巢癌細胞的生長抑制率在CAOV-3細胞中分別為77%和82%;在OVCAR-3細胞中分別為68%和74%。結(jié)論1.白藜蘆醇對兩個人卵巢癌細胞系均有生長抑制作用,誘導(dǎo)細胞凋亡,但與CAOV-3細胞相比,OVCAR-3細胞對白藜蘆醇更為敏感,提示不同的卵巢癌細胞系對白藜蘆醇的敏感性具有差異性。2.Notch、Wnt和STAT3通路在卵巢癌細胞中共活化;白藜蘆醇可抑制它們的活性并伴有三者共享的下游基因Survivn、c-Myc以及Bcl-2的表達下調(diào)。因此,白藜蘆醇抗卵巢癌作用可能具有多靶點特征。3.白藜蘆醇在減少β-catenin核易位的同時,能使其移向胞膜且以O(shè)VCAR-3更為顯著。這可能是E-cadherin表達和膜上分布增多所致,提示白藜蘆醇可誘導(dǎo)細胞分化。4.Notch信號通路特異性抑制劑L-685,458和Wnt信號通路特異性抑制劑XAV939處理后,卵巢癌CAOV-3細胞和OVCAR-3細胞均未出現(xiàn)生長抑制,提示就卵巢癌細胞增殖和生存而言,Notch信號通路和Wnt信號通路的活化與否未必關(guān)鍵。5.STAT3信號通路的特異性抑制劑AG490能夠有效抑制卵巢癌CAOV-3細胞和OVCAR-3細胞中p-STAT3的表達,阻斷STAT3信號通路的活化,從而抑制其生長。故STAT3信號通路是白藜蘆醇作用于卵巢癌的主要分子靶點之一并且該信號通路的活化對人卵巢癌的增殖和生長來說是至關(guān)重要的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 金曉琴;形態(tài)罕見的卵巢腫瘤1例[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2000年07期

2 覃英姿;卵巢腫瘤并發(fā)闌尾炎1例報告[J];中國校醫(yī);2000年02期

3 韓衛(wèi)紅,李青,李霞;經(jīng)陰道超聲在卵巢腫瘤診斷中的應(yīng)用[J];青島醫(yī)藥衛(wèi)生;2000年03期

4 ;卵巢腫瘤[J];國外科技資料目錄.醫(yī)藥衛(wèi)生;2000年10期

5 秦平,陳焰;二維超聲及彩色多普勒聯(lián)合應(yīng)用對卵巢腫瘤的診斷[J];中國超聲醫(yī)學(xué)雜志;2001年07期

6 王月香;超聲多普勒技術(shù)在卵巢腫瘤診斷上的新進展[J];河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年06期

7 崔淑莉,徐愛哲,趙世強;經(jīng)陰式彩色多普勒對卵巢腫瘤性質(zhì)判定的臨床意義[J];哈爾濱醫(yī)藥;2001年01期

8 史海英,姜勝健;卵巢腫瘤誤診13例分析[J];腫瘤防治雜志;2001年03期

9 趙信喜;微波快速石蠟切片診斷卵巢腫瘤206例分析[J];中國誤診學(xué)雜志;2001年05期

10 ;卵巢腫瘤[J];國外科技資料目錄.醫(yī)藥衛(wèi)生;2001年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李利;王超英;林忠乙;;老年卵巢腫瘤82例分析[A];中國抗癌協(xié)會婦科腫瘤專業(yè)委員會第六次全國學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

2 楊幼易;;老年婦女卵巢腫瘤手術(shù)治療140例臨床分析[A];中國抗癌協(xié)會婦科腫瘤專業(yè)委員會第六次全國學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

3 楊帆;楊太珠;羅紅;朱琦;郭文琪;田雨;陳嬌;;生育前期女性卵巢腫瘤39例超聲診斷[A];2005年全國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)學(xué)術(shù)會議西部論壇論文匯編[C];2005年

4 張海;李光展;吳瑛;盧俊;王慧芳;鄧偉蓮;;經(jīng)陰道彩色多普勒血流圖檢測卵巢腫瘤血管的臨床價值[A];中華醫(yī)學(xué)會第六次全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2001年

5 洪樹勛;許紅;曹良杰;;801例卵巢腫瘤臨床分析[A];紀(jì)念卓越的人民醫(yī)學(xué)家林巧稚大夫誕辰100周年——全國婦產(chǎn)科高級學(xué)術(shù)論壇論文集[C];2001年

6 梁元姣;葉小勤;;老年婦女雙側(cè)卵巢巨大腫瘤1例報告[A];中國抗癌協(xié)會婦科腫瘤專業(yè)委員會第六次全國學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

7 劉力;李冰琳;張啟培;;836例卵巢腫瘤臨床病理分析[A];第八次全國婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

8 陳曉玲;紀(jì)莉;吳曉燕;魚紅菊;王琳;;彩色多普勒超聲在卵巢腫瘤診斷中的應(yīng)用[A];第一屆全國婦產(chǎn)科超聲學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

9 許幼峰;郭e，

本文編號：1458968