本文關鍵詞： Phoenixin 多囊卵巢綜合征 黃體生成素 體外受精-胚胎移植 雌二醇 子宮內膜 胚胎種植 蛋白組學　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：生殖過程中機體在內外部環(huán)境作用下,外周器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)共同協(xié)作確保生物個體的成功繁殖。這個過程是通過協(xié)調生殖行為和排卵過程的下丘腦-垂體-卵巢軸完成。來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要信號是促性腺激素釋放激素(GnRH),GnRH通過調節(jié)垂體前葉促性腺激素的活性來調節(jié)卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的釋放。隨著卵巢內卵泡的發(fā)育,卵巢釋放雌二醇,負反饋調節(jié)促性腺激素釋放激素和卵泡刺激素的釋放。當雌二醇水平達到峰值,可引發(fā)促性腺激素釋放激素的快速釋放,誘發(fā)黃體生成素峰最終完成排卵過程。中樞神經(jīng)系統(tǒng)促性腺激素釋放激素的釋放有利于調節(jié)生殖行為從而為生殖調節(jié)提供一個節(jié)點。內分泌信號在控制生殖中起重要作用。個體逐漸生長足以說明中樞內分泌信號可以調節(jié)靶器官的生物過程,這種信號傳導包括基因表達,細胞因子和/或淋巴因子的釋放和激素的活性。此外,內分泌活動在胎兒的半同種異體種植過程起非常重要的作用。這種胎兒著床過程需要母親免疫細胞重編程過程使得母親在整個妊娠過程保持免疫耐受性。通常來說,母親免疫細胞是支持所有的這些過程,并且有利于成功生育。不同內分泌介導的生理和病理生理過程中從不同方面影響女性受孕過程并誘發(fā)不孕。體外受精(IVF)技術的發(fā)明是20世紀醫(yī)學界的一大奇跡,為數(shù)以萬計家庭提供了獲得子代的機會。然而,目前提高臨床妊娠率仍然是生殖醫(yī)學研究的大方向。為了改善不孕癥的結局,我們實施了以下兩個實驗并得出了相應的結論。1.背景:多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種最常見的多因素作用下的內分泌紊亂性疾病,表現(xiàn)為復雜的內分泌病理過程包括黃體生成素(LH)水平的增加,胰島素抵抗(IR)和高胰島素血癥。PCOS婦女常常表現(xiàn)為超重或者肥胖,2型糖尿病的風險增加和糖耐量受損以及心血管疾病。另外,7%生育期非PCOS婦女也常伴有高雄激素血癥和慢性無排卵。然而,許多調節(jié)蛋白對PCOS發(fā)病機制的影響仍不清楚。黃體激素(LH)控制女性月經(jīng)周期的長度和過程。重要的是,LH刺激和生成睪酮,睪酮又可以通過顆粒細胞轉化成雌激素。越來越多的證據(jù)表明PCOS同時是一種代謝紊亂性疾病,一些不利的因素直接與高LH的分泌有關。有研究者認為無排卵和PCOS患者雄激素水平升高的機制是在高LH的刺激下,卵巢的卵泡膜細胞數(shù)增加,從而使得卵泡膜細胞產(chǎn)生的雄激素增加。由于LH相對于FSH水平升高,卵巢顆粒細胞不能將雄激素芳香化轉變成雌激素,因此導致雌激素水平的下降和最終的無排卵。Phoenixin-14和Phoenixin-20是最近被分離和鑒定的兩個新的內源性神經(jīng)肽。Phoenixin-14是一種14個殘基肽,在多種生物體內發(fā)現(xiàn)存在該物質,包括人腦,大鼠,小鼠,豬和犬。而phoenixin-20則是一種20殘基肽,是Phoenixin-14N端擴展而成,在人,犬或豬序列的編碼區(qū)之間的僅存在一個氨基酸的差異。在體外,用小RNA干擾方式敲除下丘腦phoenixin的表達,可導致雌性大鼠的發(fā)情期延遲,同時伴隨著垂體GnRH受體的表達下降,提示phoenixin可能參與正常卵巢的周期調節(jié)。利用垂體前葉細胞的體外研究表明,phoenixin可通過調節(jié)垂體中促性腺激素釋放激素(GnRH)受體的表達,上調垂體促性腺激素(包括FSH和LH)的分泌,并通過GnRH增強該受體本身的上調�；谝陨涎芯炕A,認為在大鼠下丘腦-垂體-性腺軸中,phoenixin-14參與促性腺激素的分泌,本研究旨在研究PCOS患者中phoenixin-14的循環(huán)水平及其與LH分泌的關系。方法學:納入自于浙江大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院門診病人78例婦女作為研究對象(其中37例為對照組,41例為PCOS患者),年齡24-35歲。所有患者都簽署知情同意。PCOS的診斷標準依據(jù)歐洲生殖年會和美國生殖年會的聯(lián)合標準,要求患者至少符合以下三項中的兩項:1)稀發(fā)排卵或無排卵;2)臨床和/或生化高雄激素血癥(≥2.08 nmol/L);3)B超提示卵巢多囊改變(卵巢中直徑2-9mm的小卵泡≥ 12個,或卵巢體積≥ 10 cm3)。排除甲狀腺疾病,柯興氏綜合征,先天21-羥化酶缺乏,分泌雄激素的腫瘤,卵巢儲備功能下降(原發(fā)卵巢功能不全),或者1型或2型糖尿病的患者。所有納入患者都有臨床和/或生化的高雄激素血癥和慢性無排卵,絕大部分患者B超表現(xiàn)為多囊改變。對照組婦女月經(jīng)周期規(guī)則(26-30天),無上述內分泌紊亂性疾病,最近三個月內無用藥史。兩組中其他的一些排除標準包括吸煙和酗酒的患者�？崭�12小時后,在對照組和PCOS自然月經(jīng)周期的3-5天早上9時采集血液樣本。檢測所有納入的婦女中血液基礎血清卵泡刺激素(FSH),黃體生成素(LH),孕酮(P4),泌乳素(PRL)和總睪酮(TT),游離睪酮(FTT),空腹血糖(FBG),空腹胰島素(FSI),雄烯二酮(AS)和脫氫表雄酮(DHEA-S)水平。同時檢測血清中總膽固醇(TCHOL),高密度脂蛋白(HDL)膽固醇,低密度脂蛋白(LDL)膽固醇和甘油三酯(TG)的水平。激素的測定采用2006自動免疫分析儀,脂質的測定則采用Olympus臨床化學分析儀(AU2700)。HOMA胰島素抵抗指數(shù)按照標準公式計算。血液中Phoenixin-14,nesfatin-1和kisspeptin的濃度采用商業(yè)化的ELISA試劑盒進行測定。采用SPSS15.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。對照組和PCOS組之間的各項參數(shù)比較采用t檢驗,用Pearson方法分析參數(shù)之間的相關性。結果:兩組之間一般資料如年齡、BMI和生化指標如HDL,LDL,TG和TCHOL水平均無顯著差異。然而,PCOS組性激素結合球蛋白,AS,DHEA-S,TT,游離TT,LH,PRL,FSI以及HOMA-IR指數(shù)均顯著升高,但是兩組之間的P4,FSH和E2水平無差異。PCOS患者血液中phoenixin-14水平顯著較對照組升高(0.57±0.04 ng/mL vs.0.37±0.05ng/mL,n=37)。同樣,血清中nesfatin-1水平在PCOS組患者中升高明顯(p0.05)。但兩組之間血清kisspeptin水平無顯著差異。用phoenixin-14作為獨立變量,多元相關分析結果顯示在PCOS患者中,phoenixin-14與nesfatin-1和LH水平呈顯著正相關,與HOMA-IR,kisspeptin,E2,FBG和胰島素水平呈負相關,但未達統(tǒng)計學差異。結論:我們的結果指出,PCOS患者相對于正常婦女,血清中phoenixin-14顯著升高。phoenixin-14與nesfatin-1和LH水平呈顯著正相關,因此推測phoenixin-14的存在可能在一定程度上影響PCOS患者LH的分泌。然而,仍需要更多的研究來明確phoenixin-14 和 PCOS 的關系,從而有利于對 PCOS 不良生殖結局進行干預性的治療。2.背景:正常子宮內膜是一類對卵巢類固醇類激素起反應的活性組織,隨著月經(jīng)周期經(jīng)歷增殖、分化和脫落的過程。雌激素和孕激素在人子宮內膜成熟中發(fā)揮重要的作用。在增殖期,雌二醇(E2)刺激內膜上皮細胞和間質細胞成分增殖�？刂菩猿倥怕咽求w外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術中常用的手段,常伴隨著雌二醇水平的顯著升高。在IVF-ET治療過程中同時有多個卵泡成熟產(chǎn)生超生理的E2水平,引發(fā)與子宮內膜容受性相關的形態(tài)學和生物化學改變。然而,升高的E2水平對子宮內膜種植的影響仍然存在爭議。之前的研究報道血清E2水平在超促排卵過程中濃度依賴性的影響胚胎種植。臨床研究同樣獲得了一些類似的結果。在過度刺激患者中,不考慮血清中孕酮的水平,注射hCG日高E2水平不影響胚胎質量,但對子宮內膜的容受性不利。另外一個研究發(fā)現(xiàn)升高的E2水平對胚胎有毒害作用,降低胚胎粘附。鑒于血清中高水平的E2可能濃度依賴性的影響IVF妊娠結局,我們評估了生理水平的E2對子宮內膜細胞的影響,來揭示在控制性超促排卵中升高的血清E2水平對子宮內膜細胞蛋白表達的可能影響。方法學:從上海生物科學研究所獲得人類子宮內膜細胞-IK細胞,置于RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用不同濃度的E2(10-9M和10-7M)進行細胞處理,10-9ME2接近婦女月經(jīng)周期中分泌中期的生理濃度,10-7ME2接近超促排卵中超生理水平。體外粘附實驗模型采用人類絨毛膜癌細胞系JAR細胞,參照標準的操作步驟制備細胞,加入到IK細胞中培養(yǎng)一個小時,離心六孔板(10×g;10分鐘)使細胞表面朝下而分離非粘附球體。每組雌激素處理后的IK細胞用細胞裂解液裂解后收集細胞分離蛋白。送檢不同濃度雌激素處理后的IK細胞,用iTRAQ方法進行蛋白組學測定,進行液相色譜-質譜(LC-MS/MS)的四種生物重復序列的蛋白質鑒定和定量,并結合Andromeda搜索引擎使用MaxQuant(MQ)軟件進行分析。根據(jù)應用錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)與過濾出B值的比值進行選擇,即按照差異倍數(shù)≤0.67和≥1.5,或者P值≤0.05的標準過濾來選取差異蛋白。為了證實蛋白質組學結果,在兩組中通過蛋白質印跡分析驗證了三種已知在胚胎粘附中起作用的上調蛋白,包括補體(C3),纖溶酶原和激肽原-1。同時獲得5個正常排卵周期(連續(xù)觀察2個月經(jīng)周期)LH峰后7天的子宮內膜組織做免疫組化進行驗證。在子宮內膜活檢前患者均簽署知情同意書,實施的項目通過浙江大學醫(yī)學院倫理委員會審批。結果保留了所有差異蛋白(pvalue0.05以及差異倍數(shù)超過1.2倍)。然后通過分層聚類分析(聚類分析 3.0,http://bonsai.hgc.jp/～mdehoon/software/cluster/software.htm 和 Java 樹視圖軟件http://jtreeview.sourceforge.net)評估得到的差異表達蛋白進行區(qū)組。使用IPA功能分析法分析差異蛋白之間的生物調控網(wǎng)絡,疾病分析和調控通路。計算z-score可以推斷有潛在生物過程的激活狀態(tài)("激活"或"抑制")。使用作圖軟件Prism6進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。Fisher精確檢驗用于計算p值,以確定數(shù)據(jù)集中蛋白質之間的關聯(lián)以及生物過程可以單獨解釋的可能性。使用非配對t檢驗,確定兩組間比較的統(tǒng)計學意義。所有樣品都進行四個生物重復的檢測,數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差的形式表示,p0.05認為有統(tǒng)計學差異。結果:不同濃度的雌激素水平處理子宮內膜影響胚胎著床。10-9M濃度的雌激素作用后JAr粘附率為65.19±2.67%。然而,10-7M處理后的IK細胞的粘附率明顯升高,為77.78±3.39%。使用iTRAQ技術,分析獲得2,709差異表達蛋白,其中包括2,362上調蛋白和347下調蛋白。與對照組(10-9 M E2)相比,我們驗證了 10-7 M雌激素處理后的45個差異蛋白,包括43個上調蛋白和2個下調蛋白。這些差異蛋白的聚類分析顯示在熱圖中。熱圖結果顯示兩組明顯分離成兩個主要成份,提示10-7M雌激素處理組蛋白表達顯著不同于10-9M雌激素處理組。使用Western blot驗證補體C3,纖溶酶原和激肽原-1的表達與蛋白組學結果一致。結果提示高濃度雌激素處理后的IK細胞中補體C3,纖溶酶原和激肽原-1表達顯著升高,推測10-7M雌激素處理后可能增加補體C3,纖溶酶原和激肽原-1表達促進JAr粘附到內膜細胞。在子宮內膜容受階段,C3,纖溶酶原和激肽原-1在人子宮內膜中的定位表達揭示了這些蛋白質很可能是人子宮內膜容受性因子。此外,IPA分析結果顯示10-7 M雌激素處理后絕大多數(shù)的差異表達蛋白都與"分子與細胞功能","生理系統(tǒng)功能"和"疾病與病癥"有關�；谏鲜龅膒值,篩選出的差異表達蛋白其中有26個差異蛋白與子類別"生理系統(tǒng)與功能"和"疾病與紊亂"相關,而24個差異蛋白與子類別"分子和細胞功能"相關。為了理解在功能分組中顯示出顯著變化的蛋白質之間的特異性相互作用,我們利用IPA分析差異表達蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡。此外,雌激素處理后的內膜細胞呈現(xiàn)出兩種典型的信號通路,包括LXR/RXR活化途徑和通過最大數(shù)量的識別的差異表達蛋白介導的急性期反應信號以及表示由隨機機會發(fā)現(xiàn)的對數(shù)概率的z-score。子宮內膜細胞系中的差異表達蛋白主要與調節(jié)途徑相關,表明它們可能在粘附中具有關鍵作用。此外,上游調節(jié)分析可以預測上游分子,包括轉錄因子,微小RNA,激酶,化合物或藥物,這些可能引起蛋白質表達模式的改變。用雌激素培養(yǎng)的子宮內膜細胞顯示與子宮內膜容受性相關的上游調節(jié)物(TNF,IL6,Hmgn3和miR-140-3p),并且基于上述的差異表達蛋白的激活z-score來預測其為受激活或抑制狀態(tài)。結論:綜上所述,系統(tǒng)分析提供了理解子宮內膜雌激素依賴性蛋白變化的基礎,子宮內膜的蛋白質分布與一些差異蛋白質與子宮容受性有關,并表明足夠的劑量的雌激素可能作用子宮內膜胚胎界面的子宮內膜維持高反應性,提高患者胚胎著床率。此外,為了獲得足夠的證據(jù)和驗證最低的卵巢刺激對胚胎移植的影響,我們仍需要進一步的分子和臨床研究來闡明子宮內膜中劑量依賴性的雌激素對子宮內膜容受性影響的潛在機制,特別是控制性超促排卵患者卵泡期特別升高的雌二醇水平對子宮內膜的影響。這些發(fā)現(xiàn)將對于未來研究可能影響胚胎種植的蛋白質的功能也起著非常重要的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R711.6

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