本文關(guān)鍵詞： 目標基因捕獲 大規(guī)模平行測序 非侵入性產(chǎn)前測試 單基因疾病 楓糖尿病 多發(fā)畸形 染色體核型分析 微陣列比較基因組雜交　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學院》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的： 大規(guī)模平行基因測序聯(lián)合非侵入性產(chǎn)前檢測的方法，用于輔助單基因疾病-楓糖尿病的臨床診斷，對已感染的家庭進行目標測序，為單基因病的非侵入性產(chǎn)前測試，，提供了一種新的有潛力一站式檢測方法。將微陣列比較基因組雜交技術(shù)的研究，用于多發(fā)畸形胎兒的分子遺傳學分析，并探討其在輔助常規(guī)染色體核型分析中的價值。 材料與方法： 1、大規(guī)模平行基因測序聯(lián)合非侵入性產(chǎn)前檢測用于楓糖尿病的臨床研究 選取曾生育過一個楓糖尿病患兒的家庭為研究對象，運用目標大規(guī)模平行基因組測序技術(shù)，對先證者及父母的潛在突變進行了分析。為了驗證大規(guī)模平行目標測序獲得的數(shù)據(jù)，對家庭所有成員的樣本進行了實時PCR和Sanger測序。妊娠13周時從母體血漿中分離出胎兒游離DNA，運用目標性大規(guī)模平行基因組測序技術(shù)進行致病基因的檢測。基于一家三口獲得的遺傳信息，構(gòu)建了父母的單體型。胎兒的基因型是來自于父母的四種可能的遺傳合譜。母體基因型中每一種混合狀態(tài)的可能性和不同胎兒混合態(tài)，都由母體血漿的各種單核苷酸多態(tài)性計算得到。從父母單體型獲得的連鎖關(guān)系，建立了隱馬爾可夫模型，考慮到單核苷酸多態(tài)性標記的狀態(tài)和親代重組信息。通過以上策略，則胎兒的基因型和單體型可以通過一站式獲得。在妊娠19周時通過侵襲性手段獲得羊水用于產(chǎn)前遺傳診斷測試。在提取DNA后，用實時PCR和Sanger測序?qū)δ繕俗儺愡M行了驗證。再經(jīng)仔細測試后的咨詢，夫妻雙方最終決定終止妊娠。獲得了流產(chǎn)胎兒的肌肉組織，并且經(jīng)實時PCR和Sanger測序驗證。 2、比較基因組雜交技術(shù)在多發(fā)畸形中的臨床應(yīng)用 選擇2010年2月至2013年5月，在解放軍總醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，超聲診斷為胎兒全身多發(fā)畸形妊娠婦女31例，孕婦年齡20-37歲，孕周21-27周。經(jīng)知情同意后在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺獲取帶有胎兒遺傳物質(zhì)的樣本（羊水或臍血），再進行常規(guī)染色體核型分析和微陣列比較基因組雜交檢測，初步探討以上兩項新技術(shù)在胎兒多發(fā)畸形分子遺傳學檢測中的價值和臨床意義。 結(jié)果： 1、目標區(qū)大規(guī)模平行基因測序首次在中國的3人家庭中實施，他們可疑擁有一個楓糖尿病孩子，在父母和先證者中進行鑒別，找出潛在而可能引起疾病的變異。在先證者中鑒定出了BCKDHA基因的新突變：一個新的大量復(fù)制(Ex2_4dup)，來源于父親在這個位點的雜合復(fù)制，一個新的錯義突變（c.392AG），來源于母親在這個位點的雜合復(fù)制。我們以此三人家庭的測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了親代單體型，與母體血漿的測序數(shù)據(jù)相結(jié)合，又構(gòu)建了胎兒單體型，且高準確性地鑒定出來源于父母雙方的相關(guān)突變。結(jié)果顯示胎兒遺傳了2-4號外顯子的雜合復(fù)制和BCKDHA基因的新的錯義突變(c.392AG)，與先證者相同，由此表明他也是楓糖尿病患者。 2、31例多胎畸形臍血樣本，均進行了G顯帶染色體核型分析，其中4例培養(yǎng)失敗，1例無核分裂相。培養(yǎng)成功的26例中染色體核型分析正常的有23例，異常3例，核型異常率為11.54%（3/26），核型結(jié)果分別為47,xx,t(11;22(q23;q11),+der(22)t(22;11)(q11;23)；47,XN,+13；47,XN,+18。31例樣本均成功完成了微陣列比較基因組檢測，其中有4例未發(fā)現(xiàn)致病性染色體缺失/重復(fù)，21例發(fā)現(xiàn)了微缺失和微重復(fù)，但均為染色體多態(tài)性，不具有致病性。6例檢查異常，異常檢查率19.35%（6/31），與染色體核型分析的符合率為100%。其中2例為XO，1例為18三體，2例為13三體，1例為11號染色體長臂存在重復(fù)18.21Mb和22號染色體長臂存在重復(fù)3.16Mb。 結(jié)論： 1、這是在對目標區(qū)大規(guī)模平行基因測序聯(lián)合非侵入性檢測后直接應(yīng)用于臨床實踐的首次報道。開發(fā)了一項產(chǎn)前輔助單體型檢測新方法，也是對胎兒基因型進行非侵入性檢測的創(chuàng)新。我們的研究顯示基于大量平行測序的策略具有很大的潛力，在未來，可將此法能用于單基因疾病的臨床診斷。 2、非整倍體異常是多發(fā)畸形發(fā)生的重要原因，因而對超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常，特別是對多發(fā)畸形胎兒，進行細胞遺傳學檢測相當必要，直接有益于明確畸形病因和指導(dǎo)下一次妊娠。微陣列比較基因組雜交技術(shù)具有高分辨、廣泛覆蓋的優(yōu)勢，不但可以輔助常規(guī)的染色體核型分析，還可用于染色體異常的檢測。一方面彌補了培養(yǎng)失敗和細胞活力不夠無法進行檢測的缺陷，另一方面，能從亞顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)缺失和重復(fù)，對于畸形原因的分析和解釋提供了重要的依據(jù)。 3、對于中期引產(chǎn)胎兒組織檢測證實以上方法是準確而有較高臨床價值。
[Abstract]:Objective:
Massively parallel sequencing method combined with non invasive prenatal testing, to help the clinical diagnosis of single gene diseases - Maple diabetes, target sequencing of infected families, single gene disease non invasive prenatal testing, provides a new potential one-stop testing method. Research on comparative genomic technology hybridization microarray, molecular genetic analysis for multiple malformations of the fetus, and to explore the auxiliary conventional chromosome analysis in value.
Materials and methods:
1, large scale parallel gene sequencing and non invasive prenatal detection in the clinical study of maple diabetes
Select a Feng who had given birth to families of children with diabetes as the research object, using massively parallel DNA sequencing technology, the potential mutation in the proband and his parents were analyzed. In order to verify the massively parallel sequencing target data obtained for all members of the family of samples of real time PCR and Sanger sequencing. At 13 weeks gestation isolated from maternal plasma fetal DNA were detected using the target genes of massively parallel DNA sequencing technology. The genetic information of a family of three was based on the constructed haplotype parents. Fetal genotype is four possible inherited from their parents. The combined spectrum of maternal genotype in each possibility a mixed state and different fetal mixed state, by all kinds of single nucleotide polymorphisms in maternal plasma is calculated. The linkage between the haplotypes obtained from parents, a hidden The Markov model, considering the single nucleotide polymorphism status and parental recombination information. Based on the above method, then fetal genotype and haplotype can be obtained by one stop. At 19 weeks of gestation by invasive means for amniotic fluid prenatal genetic diagnosis test. In the extraction of DNA, using real-time PCR and Sanger sequencing the target mutation was verified. After carefully tested after consultation, the couple finally decided to terminate the pregnancy abortion. Fetal muscle tissue was obtained, and the real time PCR and Sanger sequencing.
2, the clinical application of comparative genomic hybridization in multiple malformations
From February 2010 to May 2013, in the prenatal diagnosis center of PLA General Hospital, ultrasound diagnosis for fetal systemic multiple malformation 31 cases of pregnant women, pregnant women aged 20-37 years old, 21-27 weeks of gestation. After informed consent in ultrasound-guided amniocentesis obtained with fetal genetic material samples (amniotic fluid or umbilical cord blood), then conventional karyotyping and microarray comparative genomic hybridization, and clinical significance of preliminary study of more than two new techniques in molecular genetics detection of fetal deformities in value.
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本文編號：1449548