發(fā)布時間：2018-01-16 03:31

  本文關(guān)鍵詞：LSD1介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)修飾促進卵巢癌細胞的遷移及侵襲　出處：《江蘇大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:LSD1參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,有報道稱LSD1在卵巢癌組織中過表達,且與患者的不良預(yù)后相關(guān),本論文主要研究了LSD1在卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用以及LSD1調(diào)控卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移的機制。方法:本研究用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,構(gòu)建LSD1穩(wěn)定表達的細胞株。首先,擴增慢病毒轉(zhuǎn)染所需的相關(guān)質(zhì)粒,提取質(zhì)粒DNA;然后使用轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞后收集病毒液,再用病毒液感染HO8910細胞,最后加puromycin篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞,并用Western blot及實時定量PCR方法驗證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞(LSD1-KD/OE-HO8910)是否成功構(gòu)建。在體外運用Transwell實驗來研究LSD1對于卵巢癌細胞遷移及侵襲的影響。將卵巢癌細胞重懸于含Dox或者TCP的無血清培養(yǎng)基中,種于Transwell小室中。向下室中加入含10%FBS的培養(yǎng)基做誘導(dǎo)劑,培養(yǎng)18 h后觀察有細胞穿到小室底膜上,加4%多聚甲醛固定30 min,然后0.1%結(jié)晶為研究LSD1對于EMT的調(diào)控作用,將LSD1-KD/OE-HO8910加不同濃度的Dox培養(yǎng)48 h后,提取總蛋白,用Western blot的方法檢測EMT相關(guān)蛋白的標記。為深入研究LSD1對于E-cadherin的調(diào)控作用,采用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法。收集大皿中的LSD1-KD-HO8910細胞,在體外用多聚甲醛固定交聯(lián)蛋白,SDS裂解液重懸交聯(lián)細胞,超聲,蛋白G瓊脂糖去除非特異性結(jié)合,加H3K4me2抗體孵育過夜,蛋白G瓊脂糖收集免疫復(fù)合物,20%SDS紫染色15 min,最后顯微鏡下觀察穿到小室膜上的細胞,并統(tǒng)計細胞數(shù)目。洗脫,然后65℃逆轉(zhuǎn)復(fù)合物,最終得到純化的DNA,用實時定量PCR檢測E-cadherin啟動子區(qū)域H3K4me2的表達情況,從而確定LSD1是否以表觀遺傳的方式調(diào)控E-cadherin的表達。結(jié)果:我們用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了LSD1穩(wěn)定過表達的細胞株(LSD1-OE-HO8910)和LSD1穩(wěn)定knockdown的細胞株(LSD1-KD-HO8910),作為研究LSD1對卵巢癌細胞遷移及侵襲作用的細胞模型。通過蛋白及RNA兩個水平驗證,LSD1-KD-HO8910細胞的LSD1表達水平以Dox濃度依賴的形式降低,而在LSD1-OE-HO8910細胞中LSD1的表達則隨Dox濃度的增加而上調(diào)。Transwell實驗的結(jié)果顯示,在LSD1-KD-HO8910細胞干擾LSD1能使細胞的遷移及侵襲能力降低;此外,TCP(LSD1酶活性抑制劑)可以抑制HO8910細胞遷移及侵襲能力;然而過表達LSD1(LSD1-OE-HO8910細胞)能使HO8910細胞的遷移及侵襲能力增加。這些結(jié)果表明LSD1在H08910細胞遷移及侵襲中扮演重要的角色。Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白的實驗結(jié)果顯示,抑制LSD1(sh-LSD1及TCP)明顯上調(diào)上皮標志基因E-cadherin的表達,同時下調(diào)間質(zhì)標志基因N-cadherin,Vimentin,MMP-2及轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達。然而在LSD1-OE-HO8910細胞中過表達LSD1產(chǎn)生相反的效果�？紤]到干擾LSD1會上調(diào)E-cadherin的表達(蛋白及mRNA水平),我們推測LSD1可能通過去除組蛋白H3K4甲基化,從而調(diào)控E-cadherin表達。為證實這一假設(shè),我們用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗來研究LSD1是否以表觀遺傳的方式調(diào)控E-cadherin表達。結(jié)果表明,干擾LSD1表達能使E-cadherin基因啟動子區(qū)域的H3K4me2水平增加,證實了我們的猜想。結(jié)論:LSD1在卵巢癌細胞遷移中起著重要作用。LSD1通過使E-cadherin啟動子區(qū)域的H3K4me2去甲基化,從而下調(diào)E-cadherin蛋白的表達,進而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生,最終促進HO8910細胞的遷移。我們的研究結(jié)果表明,LSD1可能是轉(zhuǎn)移性卵巢癌潛在的治療靶標。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of LSD1 on ovarian cancer cell migration and invasion of ovarian cancer cells by using the method of Western blot . The expression of E - cadherin was regulated by Western blot . The results showed that LSD1 could regulate E - cadherin expression by removing histone H3K4 . The results showed that LSD1 could regulate E - cadherin expression by removing histone H3K4 .

【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31

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本文編號：1431385