本文關(guān)鍵詞：沉默Piwil2表達(dá)對(duì)子宮頸癌細(xì)胞增殖和衰老的影響

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【摘要】：研究背景:宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)第一位的惡性腫瘤,全球每年大約有500,000名新發(fā)病例,其中80%在發(fā)展中國(guó)家,我國(guó)每年大約有10 000名新發(fā)病例,且近年來有年輕化趨勢(shì),高危型HPV 16、18感染作為宮頸癌的啟動(dòng)因素對(duì)于促進(jìn)癌癥的發(fā)展有至關(guān)重要的作用。目前手術(shù)和放、化療是宮頸癌主要的治療手段,但并發(fā)癥、副作用、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等使其具有局限性,迫切需要一種更為有效的治療方法來提高療效,以期達(dá)到治愈宮頸癌的目的。近年來隨著腫瘤干細(xì)胞的研究,證實(shí)腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)的根源,因此尋找一種特異性表達(dá)在腫瘤干細(xì)胞中的基因作為靶點(diǎn)會(huì)為宮頸癌的治療帶來突破。腫瘤干細(xì)胞的形成與發(fā)展主要與多種干胚胎基因、生殖干細(xì)胞基因和成體干細(xì)胞基因的是否重表達(dá)有關(guān)。雖然胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因如POU5f1(Oct-4),Nanog,Lin28B,c-Myc和Sox2等可表達(dá)在腫瘤干細(xì)胞中,但其表達(dá)并不穩(wěn)定且具有爭(zhēng)議性,而生殖干細(xì)胞相關(guān)基因如Piwil2可穩(wěn)定表達(dá)在各種腫瘤的腫瘤干細(xì)胞中,同時(shí)Piwil2可促進(jìn)原癌基因或胚胎干細(xì)胞基因如c-Myc、Lin28B、Sox2等的表達(dá)并在腫瘤干細(xì)胞多步驟演變與分化中有重要作用,因此其可能作為腫瘤檢測(cè)、診斷、治療的一個(gè)重要標(biāo)記物。Piwil2蛋白是AGO/PIWI蛋白家族的一種,正常情況下只表達(dá)在睪丸組織中,對(duì)于維持生殖干細(xì)胞的發(fā)育和配子的形成具有重要的作用。同時(shí)Piwil2蛋白可特異性表達(dá)在多種腫瘤組織和細(xì)胞系的腫瘤干細(xì)胞,從而使腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和不斷增殖等異常的表觀遺傳特性和惡性轉(zhuǎn)化能力,有利于腫瘤的形成。細(xì)胞衰老是細(xì)胞受體內(nèi)外多種因素的影響導(dǎo)致DNA斷裂損傷、氧自由基累積、端�？s短等致使生長(zhǎng)代謝不可逆性停止的現(xiàn)象。主要受細(xì)胞色素依賴激酶抑制家族如P16基因調(diào)控,導(dǎo)致相應(yīng)的端粒長(zhǎng)度縮短及端粒酶活性降低等即細(xì)胞發(fā)生衰老,其中端粒的長(zhǎng)度維持主要是由端粒逆轉(zhuǎn)錄酶h TERT決定。在多種腫瘤中P16的表達(dá)常缺如而h TERT的活性增高,而恢復(fù)P16表達(dá)的增加可抑制h TERT的表達(dá)。目的:沉默宮頸癌細(xì)胞中Piwil2基因的表達(dá),觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和衰老等生物學(xué)特性的影響,并進(jìn)一步探討其相關(guān)的分子學(xué)機(jī)制。方法:(1)Sh-piwil2質(zhì)粒采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染宮頸癌C33A和Hela細(xì)胞株,經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株C33A-sh Piwil2和He La-sh Piwil2,沉默Piwil2基因的表達(dá);熒光顯微鏡鏡檢、Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)Piwil2沉默效果。(2)采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖,集落形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆形成能力。(3)采用流式細(xì)胞周期檢測(cè)技術(shù)分析Piwil2沉默前后細(xì)胞周期分布的變化。(4)采用β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)沉默Piwil2基因?qū)?xì)胞衰老的影響。(5)運(yùn)用Q-PCR和Western blot方法檢測(cè)沉默Piwil2對(duì)P16和h TERT表達(dá)的影響。結(jié)果:(1)建立C33A-sh Piwil2和Hela-sh Piwil2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;Q-PCR與Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組Piwil2 m RNA與蛋白的表達(dá)水平均顯著降低,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)與集落形成實(shí)驗(yàn)均證明:與對(duì)照組相比,沉默Piwil2組細(xì)胞生長(zhǎng)顯著抑制,集落形成能力下降,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比Piwil2沉默后細(xì)胞的G0/G1期比例增加,S期比例減少,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示:沉默Piwil2組細(xì)胞衰老比例顯著增加,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)Q-PCR與Western blot檢測(cè)P16和h TERT表達(dá):與對(duì)照組相比,Piwil2沉默后細(xì)胞P16表達(dá)上升,而h TERT的表達(dá)下降(P0.05)。結(jié)論:(1)沉默Piwil2的表達(dá)可以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞衰老;(2)其可能的分子機(jī)制是沉默Piwil2表達(dá)可上調(diào)P16、降低h TERT表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33

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