本文關(guān)鍵詞：多靶點(diǎn)抗血管生成納米藥物應(yīng)用于卵巢癌治療的基礎(chǔ)研究

  更多相關(guān)文章： 抗腫瘤血管生成 抗腫瘤作用 納米藥物 卵巢癌

【摘要】：研究背景卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,是一種發(fā)病率高、死亡率高的婦科惡性腫瘤,近年來發(fā)病率呈逐年增加的趨勢。《2012NCCN卵巢癌臨床實(shí)踐指南(第2版)》指出,卵巢癌首選的治療方法是手術(shù)治療,然后是化療、生物學(xué)治療、激素治療、放療等。目前治療卵巢癌的化療藥物主要有紫杉醇、鉑類、曲貝替定等。卵巢癌組織有血管豐富、生長迅速的特點(diǎn),雖對(duì)化療比較敏感,但由于化療藥物的毒副反應(yīng)及長期治療產(chǎn)生的耐藥,使療效大打折扣,其五年生存率仍然很低,徘徊在30-40%。因此目前迫切需要尋找治療卵巢癌的新方法,以提高卵巢癌患者的五年生存率。卵巢癌的抗血管生成治療是近些年來研究的熱點(diǎn),尤其是以腫瘤血管為靶向的治療已成為腫瘤治療的一個(gè)前沿性課題。腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移依賴于豐富的血供及血管形成,腫瘤的新生血管不僅向腫瘤組織輸送營養(yǎng)物質(zhì)和排泄代謝廢物,而且是腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移的主要環(huán)節(jié)之一。抑制腫瘤血管生成,能顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,這為卵巢癌治療開辟了一條新的途徑。卵巢癌是一種實(shí)體腫瘤,由兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的部分組成：腫瘤實(shí)質(zhì)和腫瘤間質(zhì),在腫瘤間質(zhì)中存在著高密度的微血管,卵巢癌的生長轉(zhuǎn)移與這些微血管的形成密切相關(guān)。以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象,與直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞的化療相比具有低不良反應(yīng)、低耐藥性等優(yōu)點(diǎn)�？鼓[瘤血管生成已經(jīng)成為繼手術(shù)、化療和放療之后的“第四治療模式”。而口前應(yīng)用的大多數(shù)抗血管生成藥物針對(duì)的靶點(diǎn)單一,由于血管生成在不同生長時(shí)期存在不同的血管微環(huán)境,使其不能至始至終發(fā)揮作用。如能找到對(duì)多種促血管生成因子均有作用的藥物,或選擇多種血管生成因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的交叉點(diǎn)或多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行抑制,效果可能會(huì)更好。此外,同時(shí)針對(duì)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞治療可能產(chǎn)生更好的治療效果,因此本課題提出開發(fā)針對(duì)多個(gè)腫瘤血管生成環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)的、同時(shí)作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的抗血管生成藥物。目前抗血管生成藥物的進(jìn)藥方式主要是靜脈注射,然而由于抗血管生成藥物大多是普通劑型,在血液中容易受到各種酶類的降解,使其到達(dá)有效部位藥物濃度低,導(dǎo)致其出現(xiàn)生物利用率下降、治療效果不理想等情況。以生物大分子為載體的自組裝納米藥物具有良好的生物相容性,表面易于修飾等特點(diǎn),特別是其在腫瘤組織具有高通透性和滯留性,能夠延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,逃避網(wǎng)狀巨噬細(xì)胞的吞噬,增加藥物利用率。因此,開發(fā)多靶點(diǎn)抗血管生成納米藥物可能彌補(bǔ)這一方面的缺陷。而這種以生物大分子為載體的納米藥物可以利用其表面易于修飾等特點(diǎn),通過物理或化學(xué)方法攜帶多種活性成分,應(yīng)用這種策略于開發(fā)多靶點(diǎn)抗血管生成納米藥物,并應(yīng)用于卵巢癌治療。VEGF是特異性最強(qiáng)的促內(nèi)皮細(xì)胞分裂的生長因子,能夠與其受體VEGFR結(jié)合,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,在腫瘤組織中參與腫瘤血管的生成。VEGF通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)血管生成通過自分泌機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,來參與卵巢癌細(xì)胞的增殖浸潤和轉(zhuǎn)移,以VEGF或VEGFR為靶點(diǎn)的抗血管生成療法成為可行的意義深遠(yuǎn)的治療卵巢癌的新方法。整合素為細(xì)胞黏附分子家族的重要成員之一,主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互黏附,并介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的雙向信號(hào)傳導(dǎo)。整合素在多種腫瘤表面和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中有高表達(dá),對(duì)腫瘤血管生成起著重要作用,其中αvβ3的作用尤為重要。整合素αvβ3通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,在血管形成過程中起重要作用,因此,以αvβ3為靶點(diǎn)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡成為抗血管形成治療的一種重要的方式。肝素是一種含有長短不一的酸性粘多糖,由葡萄糖胺和葡萄糖醛酸交聯(lián)而成的粘多糖酯,含有大量硫酸基和羧基,帶大量負(fù)電荷呈強(qiáng)酸性。研究發(fā)現(xiàn)肝素能夠抑制VEGF和FGFs刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的形成,以及影響纖維蛋白凝集的結(jié)構(gòu),改變纖溶酶原激活物的敏感性。因此,肝素有良好的抗腫瘤血管形成、抗腫瘤生長作用,同時(shí)能降低細(xì)胞粘附,減少腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移。因此,肝素尤其低分子肝素作為一類新的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床有良好的應(yīng)用前景。肝素作為一種生物大分子,可以作為納米藥物的載體,也可以作為一種抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤作用的藥物。研究顯示,RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽,為αvβ3整合素受體識(shí)別,環(huán)形RGD多肽由于多價(jià)態(tài)可以同時(shí)和幾個(gè)αvβ3結(jié)合,因此較線形RGD多肽有更高的受體結(jié)合特異性。K237肽是從噬菌體中分離出來的小分子多肽,與VEGFR2有著高度的親和力,可以干擾VEGF-VEGFR2的結(jié)合。通過干擾VEGF與VEGFR2的結(jié)合,K237肽能抑制原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖。RGD肽和K237肽是短肽,易于進(jìn)行化學(xué)修飾,能夠與肝素結(jié)合自組裝成納米藥物,拮抗血管生成作用靶點(diǎn)VEGF、VEGFR2及整合素αvβ3。然而正常血管內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)VEGFR2,削弱納米藥物的對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性。為了解決這個(gè)問題,我們?cè)诩{米藥物中引入靶向腫瘤細(xì)胞的基團(tuán)。生物素(Biotin)又稱為維生素H,作為酶的輔助因子參與機(jī)體碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)和核酸的代謝,還參與信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)等。生物素通過細(xì)胞表面的多維生素轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium dependent multivitamin transporter,SMVT),內(nèi)吞入細(xì)胞發(fā)揮生理作用,腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要大量生物素,因此納米藥物中引入生物素能夠增加其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向特異性。本研究以肝素為載體,與Biotin、K237短肽、RGD環(huán)肽通過化學(xué)方法結(jié)合,制備自組裝的多靶點(diǎn)納米藥物,以血管內(nèi)皮細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞為對(duì)象,考察對(duì)納米藥物的抗血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用,并探索自組裝納米藥物的作用機(jī)制,為開發(fā)有效的抗血管生成藥物應(yīng)用于卵巢癌研究,提供研究基礎(chǔ)。第一章 多靶點(diǎn)抗血管生成納米藥物的制備和篩選目的：制備穩(wěn)定的不同含量配比的多靶點(diǎn)納米藥物,篩選出靶向性最好的多靶點(diǎn)納米藥物。方法：1.三種不同含量配比的多靶點(diǎn)納米藥物的制備丁二�；嗡厝苡�2 mL無水DMSO中,室溫下攪拌至充分溶解,依次加入生物素(Biotin)、環(huán)肽RGD、K237、EDC、NHS,室溫下攪拌反應(yīng)后,在水中透析48 h除去DMSO,得多靶點(diǎn)納米藥物。帶有熒光探針Oregon Green的多靶點(diǎn)納米藥物制備方法與其一致。40C冰箱保存,并進(jìn)行理化性質(zhì)測定。(NP1、NP2和NP3合成中丁二酰化肝素含量不同,分別是40mg、50mg和60mg,余材料加入量相同。)2.三種不同含量配比的多靶點(diǎn)納米藥物的理化性質(zhì)測定用Zetasizer Nano-Zs動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS,英國Malvern公司)測定NP1、NP2和NP3的粒徑和電位,通過透射電鏡觀察納米藥物的形態(tài)。3.激光共聚焦顯微鏡下定性分析臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞對(duì)不同靶點(diǎn)含量配比的抗血管生成納米藥物攝取情況分別用等量不同靶點(diǎn)含量配比的抗血管生成納米藥物作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和卵巢癌細(xì)胞(OVCAR-3和SKOV-3),孵育4h后,用Hochest33342染核后,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)納米分布情況。4.流式細(xì)胞儀定量分析臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞對(duì)不同靶點(diǎn)含量配比的抗血管生成納米藥物攝取情況將等量不同靶點(diǎn)含量配比的Oregon green綠色熒光標(biāo)記的抗血管生成納米藥物作用于HUVEC、OVCAR-3和SKOV-3細(xì)胞,孵育4h后,流式細(xì)胞儀定量測定這三種細(xì)胞對(duì)靶點(diǎn)含量配比不同的抗血管生成納米藥物的攝取情況。結(jié)果：1.制備得到的多靶點(diǎn)納米粒在透射電鏡下觀察納米粒呈規(guī)則球形,大小均一,無明顯聚集現(xiàn)象。動(dòng)態(tài)光散射儀顯示多靶點(diǎn)納米粒NP1粒徑約為56±7 nm,電位約為-27±4mV; NP2粒徑約為63±7 nm,電位約為-28±3mV; NP3粒徑約為80±7 nm,電位約為-29±3 mV。2.激光共聚焦顯微鏡下定性分析細(xì)胞對(duì)不同含量配比的多靶點(diǎn)納米粒攝取情況：在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中,帶綠色熒光的多靶點(diǎn)納米粒主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,說明多靶點(diǎn)納米粒能夠靶向臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞并進(jìn)入細(xì)胞中。3.流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞攝取情況：在多靶點(diǎn)納米粒中,熒光強(qiáng)度NP1NP2NP3,結(jié)果顯示NP1的靶向特異性最好。第二章 多靶點(diǎn)抗血管生成納米藥物的功能性實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯慷喟悬c(diǎn)抗血管生成納米藥物抗血管生成作用和抗腫瘤作用。方法：1、MTT法測定多靶點(diǎn)納米藥物對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的毒性效應(yīng)分別以不同濃度的LMWH和NP1作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞48 h后,MTT法測定各組細(xì)胞的相對(duì)存活率。2、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測多靶點(diǎn)納米藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外遷移的影響分別以相同濃度的LMWH和NP1作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞0 h、6h、12h、24h后,顯微鏡隨機(jī)選取三個(gè)視野拍照觀察。3、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測多靶點(diǎn)納米藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外遷移的影響分別以相同濃度的LMWH和NP1作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞12h后,收小室制片,用顯微鏡隨機(jī)選取五個(gè)視野拍照并統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)。4、小管形成實(shí)驗(yàn)檢測體外多靶點(diǎn)納米藥物對(duì)血管生成的影響采用CHEMICON in vitro angiogenesis assay (ECM625)試劑盒檢測多靶點(diǎn)納米粒對(duì)HUVEC小管形成的影響。分別以LMWH和NP1作用于體外形成的小管,10h后在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察多靶點(diǎn)納米粒體體外對(duì)血管生成的影響。5、雞胚尿囊膜血管形成實(shí)驗(yàn)測定多靶點(diǎn)納米粒對(duì)血管生成的影響將種蛋培養(yǎng)數(shù)天形成雞胚絨毛尿囊膜血管后,將LMWH(0.3 mg/mL)、NP 1(0.3 mg/mL)分別滴加在玻璃纖維素濾膜上,然后將濾膜加在已經(jīng)形成的絨毛尿囊膜遠(yuǎn)心端,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,觀察結(jié)果并拍照。6、基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)測定體內(nèi)多靶點(diǎn)納米藥物對(duì)血管生成的影響將基質(zhì)膠和藥物混勻后皮下注射于裸鼠雙側(cè)背部,14天后取出基質(zhì)膠栓,拍照觀察,并將基質(zhì)膠栓做免疫組化檢測CD34的表達(dá)。7、免疫組化測定基質(zhì)膠栓中CD34的表達(dá)為進(jìn)一步定性分析納米藥物體內(nèi)抑制腫瘤新生血管生成的能力,將基質(zhì)膠栓組織和裸鼠皮下成瘤組織行免疫組化進(jìn)行血管標(biāo)記抗體CD34染色,經(jīng)固定、石蠟包埋、脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、抗體孵育、DAB顯色、復(fù)染、透明、封片等步驟后,正置光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況并比較三組血管標(biāo)記抗體CD34表達(dá)情況有無差異并分析差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1、MTT法測定多靶點(diǎn)納米藥物對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的毒性效應(yīng)分別以不同濃度的LMWH和NP1作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞48 h后,MTT法測定各組細(xì)胞的相對(duì)存活率,結(jié)果表明多靶點(diǎn)納米藥物能夠明顯抑制HUVEC細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的增殖,并隨著濃度增加,作用增強(qiáng)。2、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測多靶點(diǎn)納米藥物對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞體外遷移的影響分別以相同濃度的LMWH和NP1作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞0 h、6 h、12 h、24 h后,顯微鏡拍照觀察。結(jié)果顯示多靶點(diǎn)納米藥物能夠抑制HUVEC細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的遷移。3、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測多靶點(diǎn)納米藥物對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞體外遷移的影響分別以相同濃度的LMWH和NP1作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞12h后,用顯微鏡隨機(jī)選取五個(gè)視野拍照并統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù),結(jié)果顯示多靶點(diǎn)納米藥物能夠抑制HUVEC細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的遷移。4、小管形成實(shí)驗(yàn)檢測多靶點(diǎn)納米藥物體外對(duì)血管生成的影響采用CHEMICON in vitro angiogenesis assay (ECM625)試劑盒檢測多靶點(diǎn)納米粒對(duì)HUVEC小管形成的作用。分別以LMWH和NP1作用于體外形成的小管,10h后在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察多靶點(diǎn)納米粒體體外對(duì)的血管生成影響。結(jié)果表明,在體外,多靶點(diǎn)納米藥物能夠明顯抑制小管形成,而LMWH基本沒有作用。5、雞胚尿囊膜血管形成實(shí)驗(yàn)測定多靶點(diǎn)納米藥物對(duì)血管生成的影響將種蛋的中上1/3去殼,培養(yǎng)直到雞胚絨毛尿囊膜血管形成,將LMWH(0.3 mg/mL)、NP1(0.3 mg/mL)分別滴加在玻璃纖維素濾膜上,然后將濾膜加在已經(jīng)形成的絨毛尿囊膜遠(yuǎn)心端,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,觀察結(jié)果并拍照。結(jié)果表明,NP1能夠明顯抑制血管生長,效果較LMWH好。6、基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)測定多靶點(diǎn)納米藥物體內(nèi)對(duì)血管生成的影響將基質(zhì)膠和藥物混勻后皮下注射于裸鼠雙側(cè)背部,7天后取出基質(zhì)膠栓,拍照觀察,結(jié)果表明在體內(nèi),NP1能夠明顯抑制血管生長,效果較LMWH好。7、免疫組化測定基質(zhì)膠栓中的CD34表達(dá)基質(zhì)膠栓從裸鼠體內(nèi)取出后,石蠟包埋,切片,選取CD34為血管標(biāo)記行免疫組化染色分析,結(jié)果顯示：空白對(duì)照組和LMWH組的CD34表達(dá)量明顯多于納米藥物組,說明與LMWH組相比,納米藥物組的血管生成明顯減少,進(jìn)一步證明納米藥物可以抑制體內(nèi)新生血管的生成。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.31

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 宋淑珍,田亞平,汪德清,紀(jì)小龍;原子力學(xué)顯微鏡對(duì)液體納米藥物的直接觀察[J];軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào);2005年05期

2 張繼瑜;劉根新;吳培星;李劍勇;董鵬程;周緒正;魏小娟;;納米藥物的研究現(xiàn)狀與展望[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(bào);2007年18期

3 耿志旺;何蘭;張啟明;楊永健;;納米藥物粒度分析方法[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2012年07期

4 王聚樂;納米藥物的研究進(jìn)展[J];西藏大學(xué)學(xué)報(bào)(漢文版);2002年03期

5 李戰(zhàn)軍;;納米藥物的制備方法[J];武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年02期

6 文聲;;納米藥物——21世紀(jì)醫(yī)學(xué)技術(shù)的重要方向[J];技術(shù)與市場;2009年04期

7 趙迎歡;Jeroen Vanden Hoven;;納米藥物的風(fēng)險(xiǎn)及控制[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(人文社會(huì)醫(yī)學(xué)版);2010年07期

8 耿志旺;何蘭;張啟明;楊永健;;納米藥物的監(jiān)督管理[J];中國藥事;2012年09期

9 ;腫瘤納米藥物研究取得重要進(jìn)展[J];技術(shù)與市場;2012年12期

10 馬t，

本文編號(hào)：1199621