本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的PI3K基因沉默對雌二醇作用人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa的影響

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【摘要】：子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer, EC)是一種女性生殖系統(tǒng)習(xí)見的惡性腫瘤,近些年來發(fā)病率呈上升趨勢。無孕激素拮抗的雌二醇長期刺激與之密切相關(guān),但雌二醇具體如何調(diào)節(jié)細胞增殖的作用機制尚無確切結(jié)論。本課題組前期研究表明,雌二醇能夠通過PI3K/Akt信號通路促進子宮內(nèi)膜癌細胞生成VEGF、bFGF、IL-8等,從而促進子宮內(nèi)膜癌細胞的發(fā)生發(fā)展。為進一步闡明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制,本研究選取PI3K為靶點,利用RNA干擾技術(shù)抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa中的PI3K基因,探究其對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的影響及其潛在作用機制。并觀察PI3K基因沉默對子宮內(nèi)膜癌細胞裸鼠移植瘤模型的影響,初步探討PI3K基因能否成為子宮內(nèi)膜癌分子治療的新靶點。第一部分慢病毒shRNA載體構(gòu)建并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞株[目的]本課題組前期發(fā)現(xiàn)雌二醇可以通過PI3K/Akt信號通路促進子宮內(nèi)膜癌細胞產(chǎn)生VEGF、bFGF、IL-8等,從而促進子宮內(nèi)膜癌細胞的發(fā)生發(fā)展,為明確PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞的相關(guān)影響機制,我們利用RNAi抑制子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa中的PI3K基因,并篩選穩(wěn)定表達的細胞株,為探究PI3K基因低表達對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞的影響奠定基礎(chǔ)。[方法]1.設(shè)計合成4組特異性針對PI3K基因的siRNA,構(gòu)建shRNA質(zhì)粒載體,感染Ishikawa細胞。2.利用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測各組對目的基因的抑制效果,篩選出沉默效果最佳的靶點。3.將選取的最佳靶點進行包裝成慢病毒shRNA載體,感染Ishikawa細胞。4.將感染目的基因的細胞Ishikawa,經(jīng)流式分選獲得穩(wěn)定的細胞株,采用RT-PCR和Western blot實驗檢測對目的基因的抑制效果。[結(jié)果]1.RT-PCR和Western blot篩選出最佳干擾靶點,siRNA序列為：GAGACCAATACTTGATGTGGTTGACTAA2.經(jīng)測序證實,運用特異性針對PI3K基因的siRNA,成功構(gòu)建了慢病毒shRNA載體,包裝滴度為8×108TU/ml。感染Ishikawa細胞,熒光倒置顯微鏡下觀察及流式細胞儀檢測,顯示各組感染效率均在90%以上,病毒感染成功。3.經(jīng)流式細胞儀分選后,RT-PCR和Western blot驗證干擾效率,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。[結(jié)論]RNA干擾技術(shù)可有效地抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa中的PI3K基因的表達,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。第二部分 慢病毒介導(dǎo)的PI3K基因沉默對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa的體外影響[目的]利用RNA干擾技術(shù)抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa中的PI3K基因的表達,檢測PI3K基因低表達后對雌二醇作用Ishikawa細胞后相關(guān)基因、蛋白的影響,觀察對其存活能力、周期、凋亡影響,探究PI3K基因低表達后對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa的影響及其潛在機制。[方法]1.RT-PCR和Western blot實驗檢測雌二醇作用感染前后Ishikawa細胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表達。2.MTT實驗檢測感染前后細胞的生長情況,分析PI3K基因沉默前后對Ishikawa細胞生存率的影響。3.細胞遷移實驗Transwell檢測感染前后細胞的體外遷移能力,分析PI3K基因沉默前后對Ishikawa細胞的體外遷移能力的影響。4.流式細胞儀檢測經(jīng)雌二醇處理后各組細胞周期及凋亡率的變化,分析PI3K基因沉默后對Ishikawa細胞周期及凋亡的影響。[結(jié)果]1.E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后,細胞的VEGF、bFGF基因和蛋白較對照組明顯增加(P0.05)；NC組與Ishikawa組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05); PI3K組細胞VEGF、bFGF基因和蛋白的表達較Ishikawa組相比明顯減少,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)2.MTT實驗結(jié)果顯示：E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后,細胞的倍增時間較對照組明顯加快(P0.05)；NC組的細胞倍增時間與Ishikawa組相比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05); PI3K組細胞的倍增時間較Ishikawa組相比明顯延長,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。3.遷移實驗顯示：E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后,穿過微孔的細胞數(shù)較對照組明顯增加(P0.05);PI3K組細胞穿過微孔的細胞個數(shù)比Ishikawa組明顯減少,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),表明PI3K低表達可以干擾E2上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細胞遷移的能力。4.細胞凋亡結(jié)果顯示：E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后,比對照組總凋亡率(%)下降,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；NC組的細胞總凋亡率(%)與Ishikawa組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05); PI3K組細胞比Ishikawa組中晚期凋亡增加,總凋亡率(%)增加,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。5.細胞周期實驗結(jié)果顯示,E2作用于未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后,比對照組的G0/G1期比率下降,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；NC組與Ishikawa組相比,各期比例差別無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);PI3K組細胞與Ishikawa組相比,G0/G1期增加,S期和G2期減少,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。[結(jié)論]PI3K基因低表達可以干擾E2在基因、蛋白水平激活子宮內(nèi)膜癌細胞產(chǎn)生VEGF、bFGF,可以下調(diào)E2對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的促進作用和凋亡機制作用,提示PI3K基因可能成為子宮內(nèi)膜癌分子治療的潛在靶點。第三部分構(gòu)建PI3K基因低表達Ishikawa細胞裸鼠移植瘤模型[目的]構(gòu)建PI3K基因低表達Ishikawa細胞的裸鼠移植瘤模型,觀察PI3K基因沉默對子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤生長的影響,進一步研究PI3K/Akt信號通路與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性,為子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供動物實驗依據(jù)。[方法]將BALB/C裸鼠隨機分為3組,每組6只。將未轉(zhuǎn)染組(Ishikawa)細胞、陰性對照組(NC)細胞及PI3K基因沉默組(PI3K-shRNA)細胞分別接種于裸鼠右側(cè)背部。觀察移植瘤成瘤情況及腫瘤生長情況,成瘤后,用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)。按照腫瘤體積計算公式：V=0.5xaxb2來計算腫瘤體積,并繪制腫瘤生長曲線。提取移植瘤組織蛋白質(zhì),應(yīng)用Western Blot檢測各組PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達。[結(jié)果]成功構(gòu)建子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型。Ishikawa組與NC組裸鼠移植體積增長沒有明顯差別(p0.05);PI3K基因低表達的PI3K組移植瘤增長較Ishikawa組明顯減慢,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與Ishikawa組、NC組相比,PI3K組裸鼠移植瘤瘤體重量明顯小于其它兩組p0.05),而Ishikawa組與NC組瘤體重量差別無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。實驗PI3K組移植瘤PI3K蛋白的表達量較Ishikawa組及NC組顯著降低(P0.05),而Ishikawa組與NC組間無顯著差異(p0.05),提示慢病毒介導(dǎo)的PI3K基因RNA干擾載體在體內(nèi)仍能穩(wěn)定遺傳并高效表達。PI3K組p-Akt、VEGF、bFGF蛋白的表達量比Ishikawa組和NC組均顯著降低(P0.05)。[結(jié)論]PI3K基因低表達抑制子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的生長,提示PI3K基因有可能成為子宮內(nèi)膜癌的分子靶點。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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本文編號：1169818