本文關(guān)鍵詞：Agrin在人乳頭瘤病毒相關(guān)宮頸癌細(xì)胞中的作用

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【摘要】：背景高危型人乳頭瘤病毒(high-riskhuman papillomaviruses,HR-HPVs),特別是HPV16和HPV18是引起宮頸癌(cervical carcinoma)的主要原因,其E6和E7基因的產(chǎn)物通過與感染細(xì)胞內(nèi)靶點的相互作用誘導(dǎo)感染細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。集聚蛋白(Agrin)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)組成成分——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfate proteoglycan,HSPG)的一種,HSPG通過參與病毒的初始結(jié)合、儲存、侵入過程和轉(zhuǎn)錄反式激活等在病毒感染中發(fā)揮重要作用。基因表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn),Agrin是正常宮頸上皮和宮頸癌組織間的一個差異表達(dá)基因,未見深入研究的相關(guān)報道。HR-HPVs相關(guān)宮頸癌發(fā)生發(fā)展中Agrin的作用、機(jī)制尚不清楚。目的本研究擬以HPV16陽性的宮頸癌Caski細(xì)胞和SiHa細(xì)胞、HPV18陽性的宮頸癌HeLa細(xì)胞、HPVs陰性的宮頸癌C33-A細(xì)胞為研究對象,研究HR-HPVs相關(guān)宮頸癌發(fā)生發(fā)展中集聚蛋白(Agrin)的作用,以豐富HR-HPVs的致癌機(jī)制。方法1.通過實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative PCR,qPCR)和Western blotting方法檢測Agrin在HPV16陽性宮頸癌Caski細(xì)胞和SiHa細(xì)胞、HPV18陽性宮頸癌HeLa細(xì)胞、HPVs陰性宮頸癌C33-A細(xì)胞中的表達(dá)。2.運(yùn)用qPCR和Western blotting方法檢測β-catenin在HPV16陽性宮頸癌Caski細(xì)胞、HPV18陽性宮頸癌HeLa細(xì)胞、HPVs陰性宮頸癌C33-A細(xì)胞中的表達(dá)。3.通過免疫熒光共定位技術(shù)驗證Agrin和β-鏈蛋白(β-catenin)在HR-HPVs相關(guān)宮頸癌細(xì)胞中的相互作用。4.設(shè)計并合成以Agrin mRNA為靶點的小干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)和陰性對照(negative control,NC)siRNA,分別命名為siRNA-Agrin和siRNA-NC。5.將siRNA-Agrin和siRNA-NC經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)入HPV16陽性宮頸癌Caski細(xì)胞、HPV18陽性宮頸癌HeLa細(xì)胞中,其中轉(zhuǎn)染siRNA-Agrin的Caski細(xì)胞和HeLa細(xì)胞分別命名為Caski-siRNA-Agrin細(xì)胞和HeLa-siRNA-Agrin細(xì)胞,轉(zhuǎn)染siRNA-NC的Caski細(xì)胞和HeLa細(xì)胞分別命名為Caski-siRNA-NC細(xì)胞和HeLa-siRNA-NC細(xì)胞。然后通過qPCR和Western blotting方法檢測沉默效果。6.通過CCK8實驗、Transwell遷移和侵襲實驗、劃痕實驗等方法觀察Agrin沉默對Caski細(xì)胞和HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果1.qPCR和Western blotting方法結(jié)果均顯示:與C33-A細(xì)胞相比,Caski細(xì)胞、SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中Agrin mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著增加(P0.01或0.05),Agrin mRNA和蛋白在4種宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)的順序均為:C33-A細(xì)胞SiHa細(xì)胞Caski細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。2.qPCR和Western blotting方法結(jié)果均顯示:β-catenin mRNA和蛋白在Caski細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于其在C33-A細(xì)胞中的表達(dá)(P0.01)。3.免疫熒光共定位技術(shù)檢測Agrin與β-catenin相互作用的結(jié)果顯示:Caski細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、C33-A細(xì)胞中均存在Agrin與β-catenin的共定位,共定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。4.Western blotting和qPCR方法檢測結(jié)果顯示:Agrin在Caski-siRNA-Agrin和HeLa-siRNA-Agrin細(xì)胞中的表達(dá)分別顯著低于其在Caski-siRNA-NC和HeLa-siRNA-NC細(xì)胞中的表達(dá)(P㩳0.01)。與Caski和HeLa細(xì)胞相比,Agrin在Caski-siRNA-NC和HeLa-siRNA-NC細(xì)胞中的表達(dá)無明顯差異(P㧐0.05)。5.CCK8檢測結(jié)果顯示:與Caski-siRNA-NC細(xì)胞和HeLa-siRNA-NC細(xì)胞相比,Caski-siRNA-Agrin和HeLa-siRNA-Agrin細(xì)胞生長速度明顯減慢(P0.01)。6.Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果均顯示:Caski-siRNA-Agrin細(xì)胞和HeLa-siRNA-Agrin細(xì)胞穿過小室底膜的細(xì)胞數(shù)分別顯著少于Caski-siRNA-NC細(xì)胞和HeLa-siRNA-NC細(xì)胞(P0.01)。7.劃痕實驗結(jié)果顯示:與Caski-siRNA-NC細(xì)胞和HeLa-siRNA-NC細(xì)胞相比,Caski-siRNA-Agrin和HeLa-siRNA-Agrin細(xì)胞遷移速度明顯減慢。結(jié)論1.HPV16和HPV18引起的宮頸癌中Agrin具有重要作用,其作用可能涉及β-catenin。2.Agrin表達(dá)沉默可顯著抑制HR-HPVs相關(guān)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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1 盧美松;鄧鎖;王澤華;;體外模擬二氧化碳人工氣腹對宮頸癌細(xì)胞生長的影響[J];中國實用婦科與產(chǎn)科雜志;2007年01期

2 周晨慧;;干擾素-γ對宮頸癌細(xì)胞免疫分子表達(dá)的影響[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2007年01期

3 潘惠艷;趙群;詹陽;趙麗紅;張衛(wèi)華;吳玉梅;;電壓門控鈉離子通道表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究[J];中國腫瘤臨床;2012年04期

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本文編號：1144115