本文關(guān)鍵詞：Agrin在人乳頭瘤病毒相關(guān)宮頸癌細胞中的作用

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【摘要】：背景高危型人乳頭瘤病毒(high-riskhuman papillomaviruses,HR-HPVs),特別是HPV16和HPV18是引起宮頸癌(cervical carcinoma)的主要原因,其E6和E7基因的產(chǎn)物通過與感染細胞內(nèi)靶點的相互作用誘導感染細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。集聚蛋白(Agrin)是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)組成成分——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfate proteoglycan,HSPG)的一種,HSPG通過參與病毒的初始結(jié)合、儲存、侵入過程和轉(zhuǎn)錄反式激活等在病毒感染中發(fā)揮重要作用�；虮磉_譜芯片分析發(fā)現(xiàn),Agrin是正常宮頸上皮和宮頸癌組織間的一個差異表達基因,未見深入研究的相關(guān)報道。HR-HPVs相關(guān)宮頸癌發(fā)生發(fā)展中Agrin的作用、機制尚不清楚。目的本研究擬以HPV16陽性的宮頸癌Caski細胞和SiHa細胞、HPV18陽性的宮頸癌HeLa細胞、HPVs陰性的宮頸癌C33-A細胞為研究對象,研究HR-HPVs相關(guān)宮頸癌發(fā)生發(fā)展中集聚蛋白(Agrin)的作用,以豐富HR-HPVs的致癌機制。方法1.通過實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time quantitative PCR,qPCR)和Western blotting方法檢測Agrin在HPV16陽性宮頸癌Caski細胞和SiHa細胞、HPV18陽性宮頸癌HeLa細胞、HPVs陰性宮頸癌C33-A細胞中的表達。2.運用qPCR和Western blotting方法檢測β-catenin在HPV16陽性宮頸癌Caski細胞、HPV18陽性宮頸癌HeLa細胞、HPVs陰性宮頸癌C33-A細胞中的表達。3.通過免疫熒光共定位技術(shù)驗證Agrin和β-鏈蛋白(β-catenin)在HR-HPVs相關(guān)宮頸癌細胞中的相互作用。4.設(shè)計并合成以Agrin mRNA為靶點的小干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)和陰性對照(negative control,NC)siRNA,分別命名為siRNA-Agrin和siRNA-NC。5.將siRNA-Agrin和siRNA-NC經(jīng)脂質(zhì)體介導分別轉(zhuǎn)入HPV16陽性宮頸癌Caski細胞、HPV18陽性宮頸癌HeLa細胞中,其中轉(zhuǎn)染siRNA-Agrin的Caski細胞和HeLa細胞分別命名為Caski-siRNA-Agrin細胞和HeLa-siRNA-Agrin細胞,轉(zhuǎn)染siRNA-NC的Caski細胞和HeLa細胞分別命名為Caski-siRNA-NC細胞和HeLa-siRNA-NC細胞。然后通過qPCR和Western blotting方法檢測沉默效果。6.通過CCK8實驗、Transwell遷移和侵襲實驗、劃痕實驗等方法觀察Agrin沉默對Caski細胞和HeLa細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果1.qPCR和Western blotting方法結(jié)果均顯示:與C33-A細胞相比,Caski細胞、SiHa細胞和HeLa細胞中Agrin mRNA和蛋白的表達均顯著增加(P0.01或0.05),Agrin mRNA和蛋白在4種宮頸癌細胞中表達的順序均為:C33-A細胞SiHa細胞Caski細胞和HeLa細胞。2.qPCR和Western blotting方法結(jié)果均顯示:β-catenin mRNA和蛋白在Caski細胞和HeLa細胞中的表達顯著高于其在C33-A細胞中的表達(P0.01)。3.免疫熒光共定位技術(shù)檢測Agrin與β-catenin相互作用的結(jié)果顯示:Caski細胞、HeLa細胞、C33-A細胞中均存在Agrin與β-catenin的共定位,共定位于細胞膜和細胞質(zhì)。4.Western blotting和qPCR方法檢測結(jié)果顯示:Agrin在Caski-siRNA-Agrin和HeLa-siRNA-Agrin細胞中的表達分別顯著低于其在Caski-siRNA-NC和HeLa-siRNA-NC細胞中的表達(P㩳0.01)。與Caski和HeLa細胞相比,Agrin在Caski-siRNA-NC和HeLa-siRNA-NC細胞中的表達無明顯差異(P㧐0.05)。5.CCK8檢測結(jié)果顯示:與Caski-siRNA-NC細胞和HeLa-siRNA-NC細胞相比,Caski-siRNA-Agrin和HeLa-siRNA-Agrin細胞生長速度明顯減慢(P0.01)。6.Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果均顯示:Caski-siRNA-Agrin細胞和HeLa-siRNA-Agrin細胞穿過小室底膜的細胞數(shù)分別顯著少于Caski-siRNA-NC細胞和HeLa-siRNA-NC細胞(P0.01)。7.劃痕實驗結(jié)果顯示:與Caski-siRNA-NC細胞和HeLa-siRNA-NC細胞相比,Caski-siRNA-Agrin和HeLa-siRNA-Agrin細胞遷移速度明顯減慢。結(jié)論1.HPV16和HPV18引起的宮頸癌中Agrin具有重要作用,其作用可能涉及β-catenin。2.Agrin表達沉默可顯著抑制HR-HPVs相關(guān)宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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2 周晨慧;;干擾素-γ對宮頸癌細胞免疫分子表達的影響[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2007年01期

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本文編號：1144115