本文關(guān)鍵詞：shRNA靶向抑制NF-κB基因治療食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的研究

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【摘要】：研究背景子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EM)是育齡期婦女中十分常見的婦科疾病,發(fā)病率大約在10%-15%,因其能夠引起嚴(yán)重的臨床癥狀,如下腹痛、痛經(jīng)、性交痛、不孕等,對廣大婦女的心身健康造成極大的影響。當(dāng)今隨著大眾健康意識的提高,發(fā)病率有逐年上升的趨勢。自從19世紀(jì)該病報導(dǎo)以來,雖然經(jīng)過對該病一個多世紀(jì)的研究,其發(fā)病機(jī)制仍不清楚�？v觀各大學(xué)說,如子宮內(nèi)膜種植學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說、淋巴和靜脈播散學(xué)說及近期報道的干細(xì)胞學(xué)說、血管形成學(xué)說、在位內(nèi)膜決定論學(xué)說、內(nèi)分泌及免疫學(xué)說等,均只能部分揭示該疾病的發(fā)生發(fā)展過程,仍無法系統(tǒng)的揭示其全面的發(fā)病機(jī)制,所以對子宮內(nèi)膜異位癥的治療目前仍無較好的方案。然而,無論何種學(xué)說,異位子宮內(nèi)膜的生長必須經(jīng)過黏附、侵襲及血管生成這3個環(huán)節(jié),因此,如能阻斷其中的某一過程,就能抑制子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。子宮內(nèi)膜異位癥雖然為良性疾病,但其具有類似腫瘤的特性,如子宮內(nèi)膜異病灶可在盆腹腔內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移,形成相應(yīng)的病變。目前,針對子宮內(nèi)膜異位癥的治療主要集中在激素類藥物及手術(shù)治療,但治療效果均不理想,復(fù)發(fā)率較高,因此,尋找新的治療方法顯得尤為重要,目前,基因治療已逐漸成為一種新的治療策略。研究顯示,核因子κB (NF-κB)作為一種核轉(zhuǎn)錄因子,最早發(fā)現(xiàn)于B淋巴細(xì)胞內(nèi),因其可與免疫球蛋白輕鏈基因增強(qiáng)子K B結(jié)合而被命名為NF-κ B,其家族中有五個成員(RelA(p65)、RelB、c. Rel、NF-κB1(p50和它的前體p105)和NF-κB2(p52和它的前體p100)),該因子廣泛存在于各種組織細(xì)胞中,正常情況下該因子以同源或者異源二聚體的形式與抑制蛋白IκB結(jié)合而存在于胞漿中,受激活因子刺激激活后,與I KB分離進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控目的基因的合成。目前發(fā)現(xiàn),該因子在調(diào)控細(xì)胞增殖、血管形成、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生理病理過程中起著非常重要的作用。有文獻(xiàn)報道,該因子與乳腺癌、前列腺癌、肺癌、直腸癌、宮頸癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過程均存在一定的相關(guān)性；同時,也有文獻(xiàn)報導(dǎo)NF-κB也參與子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過程。本課題組通過前期在裸鼠體內(nèi)的試驗也證實,NF-κB在裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,抑制NF-κB基因表達(dá)后,異位病灶明顯萎縮,微血管密度明顯減小。但裸鼠畢竟是低等動物,很多生理功能與人類差距很大,因此,本研究采用與人類最接近的大型靈長類動物作為實驗對象,通過RNA干擾技術(shù),短發(fā)夾狀RNA (shRNA)靶向抑制NF-κB基因的表達(dá),觀察其對靈長類動物子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶發(fā)生發(fā)展的影響,初步評估其對食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的體內(nèi)治療效果及其安全性。目的1.通過體外手術(shù)方法構(gòu)建食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥模型,并觀察該建模手術(shù)的效果,為構(gòu)建大型靈長類動物子宮內(nèi)膜異位癥模型增加更多的選擇。2.體外培養(yǎng)食蟹猴在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞,同時合成高特異性靶向NF-κB基因的shRNA腺病毒載體,利用該病毒載體干預(yù)原代培養(yǎng)的食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞,通過比較實驗組及對照組之間的凋亡細(xì)胞數(shù)目及凋亡蛋白的表達(dá)情況,評估其對體外培養(yǎng)的食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖活動是否具有直接的抑制效應(yīng)。3.成功構(gòu)建食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥模型后,利用前期合成的NF-κB-shRNA腺病毒載體,對內(nèi)異病灶進(jìn)行直接注射,通過靶向抑制子宮內(nèi)膜異位癥NF-κ B基因的表達(dá)后,觀察在干預(yù)后各組內(nèi)異位病灶在微血管密度、細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)及NF-κB表達(dá)等的改變,評估其在治療食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的作用,并觀察其遠(yuǎn)期毒副作用。方法1.選擇15只健康、體重相近、月經(jīng)周期規(guī)律的雌性食蟹猴,分成實驗組及對照組,實驗組12只,對照組3只,術(shù)前進(jìn)行六個月經(jīng)周期的觀察,排除不健康食蟹猴。2.在月經(jīng)周期的第8-15天,雌激素高峰的第3-5天,實驗組行手術(shù)獲取子宮內(nèi)膜組織,分別種植到自體盆腔大網(wǎng)膜、子宮直腸窩、子宮表面等處；對照組以大網(wǎng)膜組織代替子宮內(nèi)膜組織種植到相同的位置。3.分別于手術(shù)后第8周及第16周月經(jīng)周期的第8-15天行腹腔鏡探查,取可疑病灶行組織病理學(xué)檢查,觀察內(nèi)異病灶鏡下有無子宮內(nèi)膜樣腺體結(jié)構(gòu)及間質(zhì)細(xì)胞。4.設(shè)計攜帶有NF-κ B-p65基因的shRNA腺病毒載體及相應(yīng)空載shRNA腺病毒載體,并進(jìn)行體外合成。5.手術(shù)獲取新鮮食蟹猴子宮內(nèi)膜組織,體外進(jìn)行食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代培養(yǎng),分成實驗組及對照組。實驗組轉(zhuǎn)染攜帶NF-κ B-p65 shRNA的腺病毒,對照組轉(zhuǎn)染攜帶空載shRNA腺病毒載體,然后進(jìn)行共培養(yǎng)。比較兩組之間凋亡蛋白的表達(dá)及細(xì)胞周期的變化情況。6.準(zhǔn)備好構(gòu)建成功的食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥動物模型及高特異性的靶向NF-κ B基因的shRNA腺病毒及其陰性對照空載shRNA腺病毒。7.將建模成功的食蟹猴分成實驗組、陰性對照組及單純建模組,將NF-κB shRNA腺病毒在腹腔鏡下直接注入實驗組食蟹猴子宮內(nèi)膜異位病灶內(nèi),陰性對照組在病灶內(nèi)注射空載shRNA腺病毒,單純建模組病灶內(nèi)注射生理鹽水。8.注射腺病毒后4周,腹腔鏡下觀察病灶變化,取各組子宮內(nèi)膜異位病灶進(jìn)行CD34免疫組化染色檢測微血管密度,并采用蛋白印跡法(western blot)檢測NF-κB及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白的表達(dá),6個月后處死各組食蟹猴,觀察各重要臟器的遠(yuǎn)期副作用。9.統(tǒng)計學(xué)分析：本實驗所有數(shù)據(jù)計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)描述,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗,檢驗水準(zhǔn)均為α=0.05。結(jié)果1.術(shù)前對食蟹猴精神狀態(tài)、食欲、睡眠情況和月經(jīng)周期的觀察：通過近六個月經(jīng)周期的觀察,發(fā)現(xiàn)所有食蟹猴精神均良好,無嗜睡、困怠的現(xiàn)象,觀察期間,食蟹猴睡眠、食欲均良好。所有食蟹猴均有規(guī)律的月經(jīng)周期,時間大概28-30天左右,行經(jīng)4-5天,與正常婦女月經(jīng)周期類似。2.術(shù)后第8周探查顯示,15只實驗猴中,5只盆腔內(nèi)膜種植處肉眼可見疑似異位內(nèi)膜病灶改變,5只形成異位囊腫,另外2只種植處肉眼未見異位病灶存在,可疑病灶行組織病理檢查可見完整腺體和間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。3只對照組食蟹猴未見可疑病灶,取組織活檢未見整腺體和間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。術(shù)后第16周,再次行腹腔鏡探查,肉眼仍可見子宮內(nèi)膜異位病灶,并且存在不同程度的盆腔粘連,異位內(nèi)膜生長情況與術(shù)后第8周基本相似。3.成功合成了高特異性的腺病毒載體,對腺病毒載體進(jìn)行PCR和測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致, 經(jīng)包裝產(chǎn)生的病毒滴度為1.58×1011U/m1。4. NF-κ B-p65 shRNA腺病毒感染食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞后,實驗組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；實驗組進(jìn)入細(xì)胞分裂期細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組。5.實驗組食蟹猴異位病灶較前萎縮,其微血管密度(0.00198±0.0003)較陰性對照組(0.02189±0.0026)、單純建模組(0.02451±0.0033)明顯減小,分別比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。實驗組食蟹猴NF-κB蛋白的表達(dá)水平(0.338±0.174)較陰性對照組(0.678±0.021)、單純建模組(0.645±0.098)明顯下降,分別比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。實驗組食蟹猴PCNA蛋白的表達(dá)水平(0.37±0.17)低于陰性對照組(0.57±0.26)、單純建模組(0.57±0.28),分別比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論1.此次研究根據(jù)種植學(xué)說原理在國內(nèi)首次成功構(gòu)建了食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥動物模型,為以后子宮內(nèi)膜異位癥在食蟹猴的研究提供了理論基礎(chǔ),為子宮內(nèi)膜異位癥在非人靈長類動物模型的研究領(lǐng)域增加了新的動物選擇,并不是所有食蟹猴能成功構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥模型提示個體遺傳、免疫等其他因素亦可能影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。2.攜帶NF-κB基因的腺病毒體外感染食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞后可加速子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡,并抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖,為后期該基因在食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥模型上的研究提供理論基礎(chǔ)。3. NF-κB shRNA通過靶向抑制NF-κB基因的表達(dá)后,能夠抑制食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的進(jìn)展,抑制子宮內(nèi)膜異位病灶的血管生成能力,減弱異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖能力。
【關(guān)鍵詞】：子宮內(nèi)膜異位癥 食蟹猴 動物模型 NF-κB RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R711.71
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-22
• 第一部分 子宮內(nèi)膜異位癥食蟹猴動物模型的構(gòu)建22-32
• 1.1 實驗材料22
• 1.2 實驗方法22-24
• 1.3 實驗結(jié)果24-28
• 1.4 討論28-32
• 第二部分 腺病毒介導(dǎo)靶向NF-κB基因的shRNA對體外食蟹猴子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖活性的影響32-46
• 2.1 實驗材料32-33
• 2.2 實驗方法33-38
• 2.3 實驗結(jié)果38-43
• 2.4 討論43-46
• 第三部分 shRNA靶向抑制NF-κB基因治療食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的研究46-59
• 3.1 實驗材料46-47
• 3.2 實驗方法47-50
• 3.3 實驗結(jié)果50-55
• 3.4 討論55-59
• 全文小結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 攻讀學(xué)位期間成果66-67
• 致謝67-68

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1105937