本文關(guān)鍵詞：MIF介導(dǎo)的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化在宮頸癌細(xì)胞中的作用研究

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【摘要】：宮頸癌由于具有高發(fā)病率、高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性以及逐漸趨于年輕化的特點(diǎn),已成為世界范圍內(nèi)婦女的第二大惡性腫瘤。宮頸癌患者的預(yù)后與其分期密切相關(guān),對(duì)于浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移者來(lái)說(shuō),其預(yù)后相對(duì)較差,而腫瘤局限者的預(yù)后則相對(duì)較好。越來(lái)越多的研究表明在宮頸癌的發(fā)生過(guò)程中,高危型人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染是其發(fā)生發(fā)展的重要條件,但并不是所有感染高危型HPV的婦女均會(huì)發(fā)展為宮頸癌,由此我們可以推測(cè)宮頸癌的發(fā)生還有其他一些因素的共同參與。對(duì)于預(yù)后較差的宮頸癌患者來(lái)說(shuō),通常與骨盆淋巴結(jié)的受累相關(guān),可能是腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移。在腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,癌癥細(xì)胞破壞了基底膜的基本功能,使得單個(gè)的或成組的癌癥細(xì)胞獲得了侵入鄰近間質(zhì)細(xì)胞的功能。在發(fā)生此過(guò)程的初始階段,極化的上皮細(xì)胞獲得了間充質(zhì)細(xì)胞的特性,發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)。EMT在腫瘤的傳播和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中發(fā)揮重要的作用。但是目前關(guān)于宮頸癌細(xì)胞是如何獲得侵入周圍組織和轉(zhuǎn)移的能力的,還不清楚,且EMT在宮頸癌細(xì)胞和組織的作用還是鮮為人知的。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF),是前炎性細(xì)胞因子的一部分,在多種疾病的病理?yè)p傷過(guò)程發(fā)揮著重要的作用,研究表明MIF基因調(diào)控的蛋白在多種癌癥中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。本課題組經(jīng)過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)MIF在宮頸癌Si Ha細(xì)胞株中呈現(xiàn)相對(duì)較低的表達(dá)水平,而相對(duì)于宮頸癌Caski細(xì)胞株來(lái)說(shuō),MIF的表達(dá)則最高,且后續(xù)的研究在細(xì)胞水平證實(shí)過(guò)表達(dá)MIF可以促進(jìn)宮頸癌Si Ha細(xì)胞EMT的發(fā)生,促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。國(guó)外有學(xué)者研究證實(shí)過(guò)表達(dá)MIF的表達(dá)水平后,可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移;而RNA干擾沉默MIF的表達(dá)水平后,可以抑制胰腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力,但MIF能否誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT,尚未見報(bào)道。目的:1、在蛋白水平進(jìn)一步探討過(guò)表達(dá)MIF對(duì)宮頸癌Si Ha細(xì)胞中MIF蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,并進(jìn)一步檢測(cè)宮頸癌Si Ha細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin,Snail,Twist和Vimentin蛋白質(zhì)的表達(dá)變化;2、應(yīng)用RNA干擾技術(shù),將宮頸癌Caski細(xì)胞中的MIF沉默后,探討宮頸癌Caski細(xì)胞MIFm RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,并進(jìn)一步檢測(cè)上述4種EMT相關(guān)標(biāo)志物m RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。方法:1、分別構(gòu)建p EGFP-N1-MIF和p Genesil-MIF si RNA真核表達(dá)載體,同時(shí)還有其陰性的對(duì)照質(zhì)粒p EGFP-N1和p Genesil-1,構(gòu)建完成后對(duì)各組進(jìn)行提取質(zhì)粒;.2、培養(yǎng)宮頸癌Si Ha細(xì)胞系和宮頸癌Caski細(xì)胞系;3、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒p EGFP-N1-MIF和p EGFP-N1轉(zhuǎn)染至宮頸癌Si Ha細(xì)胞,而質(zhì)粒p Genesil-MIF si RNA和p Genesil-1轉(zhuǎn)染至宮頸癌Caski細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后對(duì)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察;4、將Si Ha細(xì)胞和Caski細(xì)胞分別作為各組別的空白對(duì)照組。對(duì)于Si Ha細(xì)胞組來(lái)說(shuō),在前期課題組研究的基礎(chǔ)上,使用蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測(cè)各組中MIF蛋白表達(dá)的變化以及各組中EMT的相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況:E-cadherin、Snail、Twist和Vimentin;對(duì)于Caski細(xì)胞組來(lái)說(shuō),首先采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組中MIFm RNA及蛋白表達(dá)的變化,之后進(jìn)一步檢測(cè)各組中EMT以上四種相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果:1、在倒置相差顯微鏡下,可以看到Si Ha細(xì)胞株和Caski細(xì)胞株的生長(zhǎng)情況均比較旺盛;2、成功構(gòu)建p EGFP-N1-MIF和p Genesil-MIFsi RNA真核表達(dá)載體以及各自的陰性對(duì)照質(zhì)粒p EGFP-N1和p Genesil-1;3、在轉(zhuǎn)染后6小時(shí),即可在倒置熒光顯微鏡下觀察到真核表達(dá)載體p EGFP-N1-MIF/Si Ha和p Genesil-MIF si RNA/Caski呈現(xiàn)綠色熒光,之后逐漸增強(qiáng),到48小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰,其后逐漸減弱,且越來(lái)越弱;4、對(duì)于Si Ha細(xì)胞組來(lái)說(shuō),通過(guò)Western blot法檢測(cè)證實(shí),相對(duì)于陰性質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染p EGFP-N1質(zhì)粒)和空白對(duì)照組(Si Ha細(xì)胞)來(lái)說(shuō),實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-MIF質(zhì)粒)MIF蛋白的表達(dá)要高于各對(duì)照組(P0.05),而與空白組相比,陰性質(zhì)粒組的MIF蛋白的表達(dá)與之相比兩者之間無(wú)明顯差別(P0.05),由此推測(cè)陰性對(duì)照組質(zhì)粒并不會(huì)對(duì)Si Ha細(xì)胞中的MIF蛋白產(chǎn)生影響;5、對(duì)于Caski細(xì)胞組來(lái)說(shuō),通過(guò)RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)證實(shí),相對(duì)于陰性質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染p Genesil-1質(zhì)粒)和空白對(duì)照組(Caski細(xì)胞)來(lái)說(shuō),實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染p Genesil-MIF si RNA質(zhì)粒)MIFm RNA及其蛋白的表達(dá)低于各對(duì)照組(P0.05),而與空白組相比,陰性質(zhì)粒組的MIFm RNA和蛋白的表達(dá)與之相比兩者之間無(wú)明顯差別(P0.05),證明陰性對(duì)照組質(zhì)粒并不會(huì)對(duì)Caski細(xì)胞中的MIFm RNA和蛋白產(chǎn)生影響;6、與EMT相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè):對(duì)于Si Ha細(xì)胞組,p EGFP-N1-MIF轉(zhuǎn)染Si Ha細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P0.05),間葉標(biāo)志物Vimentin,Snail和Twist蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05),而p EGFP-N1質(zhì)粒組和空白Si Ha細(xì)胞組相比,E-cadherin,Vimentin,Snail和Twist蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯變化(P0.05);對(duì)于Caski細(xì)胞組來(lái)說(shuō),p Genesil-1-MIFsi RNA轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,上皮標(biāo)志物E-cadherin m RNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P0.05),間葉標(biāo)志物Vimentin,Snail和Twist m RNA及蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.05),而p Genesil-1質(zhì)粒組和空白Caski細(xì)胞組相比,E-cadherin,Vimentin,Snail和Twist m RNA和蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯變化(P0.05)結(jié)論:1、過(guò)表達(dá)宮頸癌Si Ha細(xì)胞中的MIF后,上皮細(xì)胞的間質(zhì)化水平相應(yīng)的增高:上皮特征性標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平降低,間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin,Snail和Twist的表達(dá)水平升高;2、當(dāng)沉默宮頸癌Caski細(xì)胞中MIF的表達(dá)水平后,上皮細(xì)胞的間質(zhì)化水平相應(yīng)的降低:上皮特征性標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平升高,間充質(zhì)的標(biāo)志物Vimentin,Snail和Twist的表達(dá)水平降低;3、MIF的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞EMT的發(fā)生;而MIF沉默后可以抑制宮頸癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 侵襲 轉(zhuǎn)移 宮頸癌
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 常用縮寫詞中英文對(duì)照表14-15
• 前言15-17
• 第一部分 過(guò)表達(dá)MIF對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響17-38
• 1 材料與方法17-31
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器17-23
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法23-30
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理30-31
• 2 結(jié)果31-34
• 2.1 轉(zhuǎn)染情況31
• 2.2 過(guò)表達(dá)MIF對(duì)各組細(xì)胞MIF蛋白表達(dá)的作用31
• 2.3 過(guò)表達(dá)MIF后各組細(xì)胞中EMT相關(guān)的標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist蛋白表達(dá)變化31-34
• 3 討論34-37
• 4 結(jié)論37-38
• 第二部分RNA干擾MIF對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響38-51
• 1 材料與方法38-44
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器38-39
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法39-43
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法43-44
• 2 結(jié)果44-48
• 2.1 轉(zhuǎn)染情況44
• 2.2 RNA干擾對(duì)Caski細(xì)胞MIFmRNA和蛋白表達(dá)的作用44
• 2.3 RNA干擾MIF后Caski細(xì)胞中EMT相關(guān)的標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist mRNA表達(dá)變化44-45
• 2.4 RNA干擾后Caski細(xì)胞中EMT的標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist蛋白表達(dá)變化45-48
• 3 討論48-50
• 4 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 綜述56-67
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 致謝67-69
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果69-70
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 謝靈遐;胡麗娜;;宮頸癌發(fā)生的炎癥機(jī)理[J];華西醫(yī)學(xué);2008年01期

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本文編號(hào)：1098648