本文關鍵詞：MIF介導的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化在宮頸癌細胞中的作用研究

  更多相關文章： 巨噬細胞移動抑制因子 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 侵襲 轉(zhuǎn)移 宮頸癌

【摘要】：宮頸癌由于具有高發(fā)病率、高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性以及逐漸趨于年輕化的特點,已成為世界范圍內(nèi)婦女的第二大惡性腫瘤。宮頸癌患者的預后與其分期密切相關,對于浸潤轉(zhuǎn)移者來說,其預后相對較差,而腫瘤局限者的預后則相對較好。越來越多的研究表明在宮頸癌的發(fā)生過程中,高危型人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染是其發(fā)生發(fā)展的重要條件,但并不是所有感染高危型HPV的婦女均會發(fā)展為宮頸癌,由此我們可以推測宮頸癌的發(fā)生還有其他一些因素的共同參與。對于預后較差的宮頸癌患者來說,通常與骨盆淋巴結(jié)的受累相關,可能是腫瘤細胞已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移。在腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中,癌癥細胞破壞了基底膜的基本功能,使得單個的或成組的癌癥細胞獲得了侵入鄰近間質(zhì)細胞的功能。在發(fā)生此過程的初始階段,極化的上皮細胞獲得了間充質(zhì)細胞的特性,發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)。EMT在腫瘤的傳播和轉(zhuǎn)移擴散中發(fā)揮重要的作用。但是目前關于宮頸癌細胞是如何獲得侵入周圍組織和轉(zhuǎn)移的能力的,還不清楚,且EMT在宮頸癌細胞和組織的作用還是鮮為人知的。巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF),是前炎性細胞因子的一部分,在多種疾病的病理損傷過程發(fā)揮著重要的作用,研究表明MIF基因調(diào)控的蛋白在多種癌癥中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。本課題組經(jīng)過前期的實驗研究證實MIF在宮頸癌Si Ha細胞株中呈現(xiàn)相對較低的表達水平,而相對于宮頸癌Caski細胞株來說,MIF的表達則最高,且后續(xù)的研究在細胞水平證實過表達MIF可以促進宮頸癌Si Ha細胞EMT的發(fā)生,促進其侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。國外有學者研究證實過表達MIF的表達水平后,可以促進胰腺癌細胞EMT的發(fā)生,促進其侵襲和轉(zhuǎn)移;而RNA干擾沉默MIF的表達水平后,可以抑制胰腺癌細胞EMT的發(fā)生,降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力,但MIF能否誘導宮頸癌細胞發(fā)生EMT,尚未見報道。目的:1、在蛋白水平進一步探討過表達MIF對宮頸癌Si Ha細胞中MIF蛋白質(zhì)表達的影響,并進一步檢測宮頸癌Si Ha細胞中EMT相關標志物E-cadherin,Snail,Twist和Vimentin蛋白質(zhì)的表達變化;2、應用RNA干擾技術,將宮頸癌Caski細胞中的MIF沉默后,探討宮頸癌Caski細胞MIFm RNA和蛋白質(zhì)表達的變化,并進一步檢測上述4種EMT相關標志物m RNA和蛋白質(zhì)的表達變化。方法:1、分別構(gòu)建p EGFP-N1-MIF和p Genesil-MIF si RNA真核表達載體,同時還有其陰性的對照質(zhì)粒p EGFP-N1和p Genesil-1,構(gòu)建完成后對各組進行提取質(zhì)粒;.2、培養(yǎng)宮頸癌Si Ha細胞系和宮頸癌Caski細胞系;3、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒p EGFP-N1-MIF和p EGFP-N1轉(zhuǎn)染至宮頸癌Si Ha細胞,而質(zhì)粒p Genesil-MIF si RNA和p Genesil-1轉(zhuǎn)染至宮頸癌Caski細胞,轉(zhuǎn)染后對各組細胞的轉(zhuǎn)染情況在倒置熒光顯微鏡下進行觀察;4、將Si Ha細胞和Caski細胞分別作為各組別的空白對照組。對于Si Ha細胞組來說,在前期課題組研究的基礎上,使用蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測各組中MIF蛋白表達的變化以及各組中EMT的相關基因蛋白的表達情況:E-cadherin、Snail、Twist和Vimentin;對于Caski細胞組來說,首先采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法檢測各組中MIFm RNA及蛋白表達的變化,之后進一步檢測各組中EMT以上四種相關基因的表達情況。結(jié)果:1、在倒置相差顯微鏡下,可以看到Si Ha細胞株和Caski細胞株的生長情況均比較旺盛;2、成功構(gòu)建p EGFP-N1-MIF和p Genesil-MIFsi RNA真核表達載體以及各自的陰性對照質(zhì)粒p EGFP-N1和p Genesil-1;3、在轉(zhuǎn)染后6小時,即可在倒置熒光顯微鏡下觀察到真核表達載體p EGFP-N1-MIF/Si Ha和p Genesil-MIF si RNA/Caski呈現(xiàn)綠色熒光,之后逐漸增強,到48小時時達到高峰,其后逐漸減弱,且越來越弱;4、對于Si Ha細胞組來說,通過Western blot法檢測證實,相對于陰性質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染p EGFP-N1質(zhì)粒)和空白對照組(Si Ha細胞)來說,實驗組(轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-MIF質(zhì)粒)MIF蛋白的表達要高于各對照組(P0.05),而與空白組相比,陰性質(zhì)粒組的MIF蛋白的表達與之相比兩者之間無明顯差別(P0.05),由此推測陰性對照組質(zhì)粒并不會對Si Ha細胞中的MIF蛋白產(chǎn)生影響;5、對于Caski細胞組來說,通過RT-PCR法和Western blot法檢測證實,相對于陰性質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染p Genesil-1質(zhì)粒)和空白對照組(Caski細胞)來說,實驗組(轉(zhuǎn)染p Genesil-MIF si RNA質(zhì)粒)MIFm RNA及其蛋白的表達低于各對照組(P0.05),而與空白組相比,陰性質(zhì)粒組的MIFm RNA和蛋白的表達與之相比兩者之間無明顯差別(P0.05),證明陰性對照組質(zhì)粒并不會對Caski細胞中的MIFm RNA和蛋白產(chǎn)生影響;6、與EMT相關指標的檢測:對于Si Ha細胞組,p EGFP-N1-MIF轉(zhuǎn)染Si Ha細胞后,與對照組相比,上皮標志物E-cadherin蛋白表達水平下調(diào)(P0.05),間葉標志物Vimentin,Snail和Twist蛋白表達水平顯著上調(diào)(P0.05),而p EGFP-N1質(zhì)粒組和空白Si Ha細胞組相比,E-cadherin,Vimentin,Snail和Twist蛋白的表達均無明顯變化(P0.05);對于Caski細胞組來說,p Genesil-1-MIFsi RNA轉(zhuǎn)染Caski細胞后,與對照組相比,上皮標志物E-cadherin m RNA及蛋白表達水平上調(diào)(P0.05),間葉標志物Vimentin,Snail和Twist m RNA及蛋白表達水平顯著下調(diào)(P0.05),而p Genesil-1質(zhì)粒組和空白Caski細胞組相比,E-cadherin,Vimentin,Snail和Twist m RNA和蛋白的表達均無明顯變化(P0.05)結(jié)論:1、過表達宮頸癌Si Ha細胞中的MIF后,上皮細胞的間質(zhì)化水平相應的增高:上皮特征性標志物E-cadherin的表達水平降低,間充質(zhì)標志物Vimentin,Snail和Twist的表達水平升高;2、當沉默宮頸癌Caski細胞中MIF的表達水平后,上皮細胞的間質(zhì)化水平相應的降低:上皮特征性標志物E-cadherin的表達水平升高,間充質(zhì)的標志物Vimentin,Snail和Twist的表達水平降低;3、MIF的過表達可以促進宮頸癌細胞EMT的發(fā)生;而MIF沉默后可以抑制宮頸癌細胞EMT的發(fā)生。
【關鍵詞】：巨噬細胞移動抑制因子 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 侵襲 轉(zhuǎn)移 宮頸癌
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 常用縮寫詞中英文對照表14-15
• 前言15-17
• 第一部分 過表達MIF對宮頸癌SiHa細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響17-38
• 1 材料與方法17-31
• 1.1 主要實驗材料、試劑與儀器17-23
• 1.2 實驗方法23-30
• 1.3 統(tǒng)計學處理30-31
• 2 結(jié)果31-34
• 2.1 轉(zhuǎn)染情況31
• 2.2 過表達MIF對各組細胞MIF蛋白表達的作用31
• 2.3 過表達MIF后各組細胞中EMT相關的標志物E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist蛋白表達變化31-34
• 3 討論34-37
• 4 結(jié)論37-38
• 第二部分RNA干擾MIF對宮頸癌Caski細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響38-51
• 1 材料與方法38-44
• 1.1 主要實驗材料、試劑與儀器38-39
• 1.2 實驗方法39-43
• 1.3 統(tǒng)計學方法43-44
• 2 結(jié)果44-48
• 2.1 轉(zhuǎn)染情況44
• 2.2 RNA干擾對Caski細胞MIFmRNA和蛋白表達的作用44
• 2.3 RNA干擾MIF后Caski細胞中EMT相關的標志物E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist mRNA表達變化44-45
• 2.4 RNA干擾后Caski細胞中EMT的標志物E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist蛋白表達變化45-48
• 3 討論48-50
• 4 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-56
• 綜述56-67
• 參考文獻62-67
• 致謝67-69
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果69-70
• 個人簡歷70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 謝靈遐;胡麗娜;;宮頸癌發(fā)生的炎癥機理[J];華西醫(yī)學;2008年01期

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本文編號：1098648