本文關(guān)鍵詞：隨機(jī)噬菌體12肽庫篩選宮頸癌患者血清腫瘤標(biāo)志物的初步研究

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【摘要】：背景宮頸癌在發(fā)展中國家上升為第2位女性常見的惡性腫瘤,僅次于乳腺癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計,在宮頸癌每年新發(fā)病例數(shù)中,中國約占世界總發(fā)病數(shù)的28%。已嚴(yán)重威脅中國女性健康,造成社會的重大負(fù)擔(dān)。但宮頸癌早期發(fā)現(xiàn)后及時治療效果顯著、預(yù)后良好。有文獻(xiàn)報道早期宮頸癌的5年生存率可達(dá)92%,因此宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)、早期診斷和治療是非常重要的。目前宮頸癌的診斷方法包括傳統(tǒng)的宮頸涂片細(xì)胞學(xué)檢查、陰道鏡檢查和組織學(xué)檢查。一定程度上提高了宮頸癌在早期的診斷,但這些方法依然仍有各自的缺陷,如巴氏涂片檢查靈敏度低,陰道鏡檢查難以檢查到細(xì)小的病灶,組織活檢的依從性差等。近年血清腫瘤標(biāo)志物如糖鏈抗原199(CA199)、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)、血清糖類抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)已作為宮頸癌的輔助檢測項目,但其總的靈敏度和特異度并不高。所以尋找一種針對早期宮頸癌其靈敏度和特異度都高的血清腫瘤標(biāo)志物非常重要。Smith發(fā)明的噬菌體展示技術(shù)(PDT)對尋找腫瘤血清標(biāo)志物提供了條件,本研究利用PDT,以早期宮頸癌患者血清為靶分子,可能篩選出與宮頸癌患者血清特異性結(jié)合的短肽。目的用隨機(jī)噬菌體12肽庫對宮頸癌患者血清進(jìn)行三輪差異性淘選,找出能與宮頸癌患者血清特異性結(jié)合的陽性噬菌體株,通過擴(kuò)大樣本和與不同種類的腫瘤患者血清進(jìn)行再鑒定,挑出與早期宮頸癌患者血清特異結(jié)合且親和力最高的噬菌體株,將其提取單鏈DNA后進(jìn)行測序得到相應(yīng)短肽,為宮頸癌的早期診斷提供新的腫瘤標(biāo)志物,為進(jìn)一步尋找宮頸癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。方法 1.采取6例正常人血清及6例早期宮頸癌患者新鮮血清分別混合包被在96孔酶標(biāo)板中(兩孔正常人血清,一孔宮頸癌患者血清),進(jìn)行三輪差異性篩選,每輪都先將噬菌體肽庫與前兩孔正常人血清結(jié)合,再將剩余未結(jié)合噬菌體移至第三孔與早期宮頸癌患者血清結(jié)合,結(jié)合后用洗脫液洗脫第三孔與早期宮頸癌患者血清結(jié)合的噬菌體,并對其進(jìn)行擴(kuò)增,通過三輪的篩選與擴(kuò)增,與早期宮頸癌患者血清親和力高的噬菌體得到富集,得到特異性結(jié)合的陽性噬菌體。2.用最后一輪篩選所得的噬菌體劃板培養(yǎng)。在每塊板上選取多個相對距離較遠(yuǎn)的單克隆噬菌體株,對其擴(kuò)增,然后用篩選時的6例正常人血清及6例早期宮頸癌患者血清用ELISA法檢測所選取的各單克隆噬菌體株與早期宮頸癌患者血清的親和力,選取出顏色穩(wěn)定且差別明顯的幾株陽性噬菌體。3.再擴(kuò)大樣本含量檢測所篩選出的噬菌體對早期宮頸癌患者血清的親和力,挑選出與早期宮頸癌患者血清結(jié)合親和力最好的噬菌體株。4.對挑選出的陽性噬菌體株提取其單鏈DNA進(jìn)行測序,再根據(jù)遺傳密碼表得到相應(yīng)的短肽。結(jié)果 通過三輪篩選,與宮頸癌患者血清結(jié)合的噬菌體富集率逐輪提高,提高近100倍。挑取單個噬菌體株后經(jīng)反復(fù)ELISA驗證后得到特異性較好的7號噬菌體株。7號噬菌體克隆行ELISA檢測6例正常人血清及6例宮頸癌患者血清,結(jié)果顯示正常人組OD值為0.056±0.010,宮頸癌組為0.151±0.040,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；7號噬菌體克隆行ELISA檢測50例正常人血清及50例宮頸癌患者血清,結(jié)果顯示正常人組OD值為0.070±0.023,宮頸癌組為0.157±0.040,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；ELISA驗證7號噬菌體克隆分別與8例宮頸癌患者血清、8例CIN患者血清、8例卵巢癌患者血清及8例正常人血清行ELISA檢測,結(jié)果顯示宮頸癌患者組OD值為0.174±0.018,卵巢癌組為0.052±0.007,CIN組為0.076±0.010,正常人組為0.052±0.006,宮頸癌組與其他組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分析7號噬菌體ROC曲線下面積為0.956,P0.0001,有統(tǒng)計學(xué)意義,ROC曲線下面積95%的可信區(qū)間為[0.896,0.987]；Medcalc軟件分析其特異度為94%及敏感性為84%;7號噬菌體測序結(jié)果為：5'-ATG CAC CGG ACG CGT CAG CGA ACC ATT CGT AGC CGA-3',氨基酸序列為：SATNGSLTRPVH。7號噬菌體克隆的DNA序列與鼠類、人類行同源核酸比對,未見其同源序列；將7號噬菌體克隆的氨基酸序列進(jìn)行比對,未發(fā)現(xiàn)與該氨基酸同源的蛋白結(jié)構(gòu),與已知的蛋白多肽序列的相似性也不高。結(jié)論：可能淘選出與早期宮頸癌患者血清特異結(jié)合且高親和力的短肽,為以后研究宮頸癌腫瘤標(biāo)志物及宮頸癌的早期診斷、預(yù)后及復(fù)發(fā)監(jiān)測奠定了基礎(chǔ),也有助于宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。
【關(guān)鍵詞】：噬菌體隨機(jī)肽庫 宮頸癌 腫瘤標(biāo)志物
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 個人簡歷3-9
• 摘要9-12
• Abstract12-16
• 前言16-19
• 1 材料19
• 2 試劑19-22
• 3 主要設(shè)備22
• 4 實驗步驟22-30
• 4.1 Ecoli ER2738大腸桿菌株的活化及培養(yǎng)22
• 4.2 對宮頸癌患者血清的減性篩選22-26
• 4.3 噬菌體滴度測定的方法26-27
• 4.4 噬菌斑的擴(kuò)增27
• 4.5 用ELISA法檢測所篩選噬菌體克隆與靶分子的結(jié)合27-29
• 4.6 提純陽性噬菌體測序模板29-30
• 4.7 陽性噬菌體DNA的測序30
• 4.8 統(tǒng)計和生物信息學(xué)分析方法30
• 5 結(jié)果30-45
• 5.1 三輪遞減篩選后陽性噬菌體的得率30-32
• 5.2 陽性噬菌體所表達(dá)多肽的ELISA檢測32-37
• 5.3 繪制7號噬菌體克隆的ROC曲線及分析其曲線下面積37-39
• 5.4 測序39-45
• 6 討論45-51
• 結(jié)論51-52
• 綜述：宮頸癌腫瘤標(biāo)志物診斷及預(yù)后研究進(jìn)展52-60
• 1 人乳頭瘤病毒52-53
• 2 腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡標(biāo)志物53-55
• 3 腫瘤相關(guān)性抗原55-56
• 4 MA15356-57
• 5 OPN57-58
• 6 DNA甲基化58
• 7 細(xì)胞角蛋白58-59
• 8 結(jié)語59-60
• 參考文獻(xiàn)60-73
• 致謝73-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文74

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1092496