本文關(guān)鍵詞：CRABP2基因過表達(dá)逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥對腫瘤微環(huán)境影響探究及卵巢癌3D共培養(yǎng)初探

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【摘要】：目的 本課題組在前期已經(jīng)成功建立了卵巢癌的裸鼠順鉑耐藥模型,得到順鉑獲得性耐藥卵巢癌細(xì)胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ,然后成功構(gòu)建了CRABP2基因過表達(dá)的順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2,并且采用]mcherry紅色熒光標(biāo)記。檢測CRABP2基因過表達(dá)后對卵巢癌微環(huán)境中細(xì)胞因子的影響以及CRABP2基因過表達(dá)逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞鉑類耐藥在動物模型中的表達(dá)驗證,探討CRABP2基因過表達(dá)后對細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期信號通路的影響。另外,建立SKOV3/DDPⅢ與間皮細(xì)胞,成纖維細(xì)胞三維共培養(yǎng)模型更好地模擬卵巢癌細(xì)胞的生長微環(huán)境,對三維共培養(yǎng)方法進(jìn)行初探。為尋找逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的新的靶點奠定基礎(chǔ)。方法利用課題組前期已經(jīng)成功建立的順鉑獲得性卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ和親本順鉑敏感細(xì)胞株SKOV3-GFP,分別種植在裸鼠皮下待其成瘤后分次順鉑體內(nèi)干預(yù),實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子的動態(tài)表達(dá)變化。利用CRABP2基因過表達(dá)的順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2和空載對照組細(xì)胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-mcherry,分別種植在裸鼠皮下待其成瘤后分次順鉑體內(nèi)干預(yù),Western Blot檢測CRABP2基因過表達(dá)后對移植瘤下游Fas細(xì)胞凋亡信號通路上節(jié)點基因的蛋白表達(dá)和周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。同時進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子的動態(tài)表達(dá)變化。采集人腹腔大網(wǎng)膜標(biāo)本,分離純化得到間皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。利用Transwell小室,間皮細(xì)胞,成纖維細(xì)胞,SKOV3/DDPⅢ搭建三維共培養(yǎng)模型,底層為成纖維細(xì)胞,中層為間皮細(xì)胞,上層為SKOV3/DDPⅢ利用Clarity法包埋成去脂透明的高通透性立體模型,利用免疫熒光法觀察三維共培養(yǎng)模型并進(jìn)行三維成像。結(jié)果QRT-PCR的結(jié)果表明：注射順鉑藥物后,敏感組表達(dá)高于耐藥組的細(xì)胞因子有22個：敏感組表達(dá)低于耐藥組的細(xì)胞因子有5個。在過表達(dá)CRABP2基因和其空載對照組中,注射順鉑藥物后,空載對照組表達(dá)低于過表達(dá)CRABP2組的細(xì)胞因子有20個；空載對照組表達(dá)高于過表達(dá)CRABP2組的細(xì)胞因子有7個。注射順鉑藥物后,空載對照組表達(dá)高于過表達(dá)CRABP2組中有4個細(xì)胞因子與注射順鉑藥物后的敏感組表達(dá)低于耐藥組的細(xì)胞因子相同,過表達(dá)CRABP2組表達(dá)高于空載對照組中有19個細(xì)胞因子與敏感組表達(dá)高于耐藥組的細(xì)胞因子相同。因此,過表達(dá)CRABP2基因通過影響腫瘤的微環(huán)境來逆轉(zhuǎn)卵巢癌的鉑類耐藥。相對于SKOV3-GFP/DDPII和空載對照組的SKOV3-GFP/DDPII-mcherry細(xì)胞株的裸鼠皮下移植瘤而言,過表達(dá)CRABP2的SKOV3-GFP/ DDPII-CRABP2細(xì)胞株的裸鼠皮下移植瘤的細(xì)胞周期被抑制,細(xì)胞凋亡途徑被激活：隨順鉑注射次數(shù)的增加,Fas信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的Fas, FADD, Caspase9和Caspase3在過表達(dá)CRABP2移植瘤組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)相對于耐藥移植瘤組織和它的空載對照移植瘤組織呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(P0.05),而PARP1則在過表達(dá)CRABP2移植瘤組織中蛋白質(zhì)表達(dá)相對于耐藥組織和它的空載對照移植瘤組織呈現(xiàn)出下調(diào)趨勢(P0.05)；隨著順鉑次數(shù)的增加,細(xì)胞周期的依賴性蛋白激酶CDK6, CDK4和細(xì)胞周期蛋白cyclinDl在過表達(dá)CRABP2移植瘤組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)相對于耐藥移植瘤組織和它的空載對照移植瘤組織呈現(xiàn)出下調(diào)趨勢(P0.05),而細(xì)胞周期阻斷劑p27 kip1則在過表達(dá)CRABP2移植瘤組織中蛋白質(zhì)表達(dá)相對于耐藥組織和它的空載對照移植瘤組織呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(P0.05)。即過表達(dá)CRABP2基因后的卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞恢復(fù)了對順鉑的敏感性。三位共培養(yǎng)模型免疫熒光觀察上層為SKOV3/DDPIII,中間為間皮細(xì)胞,下層為混有成纖維細(xì)胞的基質(zhì)膠。結(jié)論過表達(dá)CRABP2后可使耐藥的卵巢癌細(xì)胞恢復(fù)對順鉑的敏感性,影響腫瘤的微環(huán)境抑制細(xì)胞周期中的G1/S期、激活Fas凋亡信號通路的作用來逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥。這給臨床上逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥的治療提供了新的靶點和理論基礎(chǔ)。并且利用三維共培養(yǎng)模型可以更好地模擬卵巢癌細(xì)胞的生長微環(huán)境來研究腫瘤微環(huán)境對鉑類耐藥的影響。
【關(guān)鍵詞】：卵巢上皮癌 鉑類耐藥 CRABP2 微環(huán)境 細(xì)胞因子 三維共培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 個人簡歷3-6
• 主要中英文縮略語對照6-10
• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-17
• 第一章 腫瘤微環(huán)境在卵巢癌復(fù)發(fā)耐藥機(jī)制中的作用(文獻(xiàn)綜述)17-34
• 1 腫瘤微環(huán)境17-18
• 2. 基質(zhì)細(xì)胞與卵巢癌復(fù)發(fā)耐藥18-22
• 3. 細(xì)胞因子與卵巢癌復(fù)發(fā)耐藥22-28
• 4. 免疫細(xì)胞與卵巢癌復(fù)發(fā)耐藥28-29
• 5. 腫瘤干細(xì)胞與卵巢癌復(fù)發(fā)耐藥29-30
• 6 脈管系統(tǒng)與卵巢癌復(fù)發(fā)耐藥30-31
• 7. 腫瘤酸性環(huán)境、低氧環(huán)境介導(dǎo)的卵巢癌復(fù)發(fā)耐藥31
• 8. 癌細(xì)胞在微環(huán)境中耐藥性形成的分子機(jī)制和對微環(huán)境的影響31-32
• 9. 結(jié)語32-34
• 第二章 鉑類耐藥動物模型中腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子的動態(tài)變化34-56
• 前言34
• 1 實驗材料34-37
• 2 實驗方法37-44
• 3 結(jié)果44-51
• 4 討論51-56
• 第三章 過表達(dá)CRABP2基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞鉑類耐藥在動物模型中的表達(dá)驗證56-76
• 前言56-57
• 1 實驗材料57-61
• 2 實驗方法61-67
• 3 結(jié)果67-72
• 4 討論72-76
• 第四章 CRABP2調(diào)控腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥的機(jī)制76-86
• 前言76
• 1 實驗材料76
• 2 實驗方法76-78
• 3 結(jié)果78-85
• 4 討論85-86
• 第五章 三維共培養(yǎng)模型模擬腫瘤微環(huán)境方法初探86-96
• 前言86
• 1 實驗材料86-87
• 2 實驗方法87-91
• 3 結(jié)果91-94
• 4 討論94-96
• 第五章 全文總結(jié)96-97
• 參考文獻(xiàn)97-113
• 附錄113-122
• 致謝122

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