【摘要】： 冠狀動脈術(shù)后再狹窄(Restenosis)是指成功的冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)或經(jīng)皮介導(dǎo)的冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)后再次發(fā)生血管狹窄，其發(fā)生率約為30％-50％。再狹窄的發(fā)生使手術(shù)的療效明現(xiàn)減低。再狹窄是局部血管對于機械性損傷的過度修復(fù)反應(yīng)，與血管中層平滑肌細(xì)胞(VSMC)向內(nèi)膜下的遷移、增生和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌密切相關(guān)。血小板衍化生長因子(PDGF)及其β受體在此過程中起重要作用。目前，再狹窄的防治措施均不理想。放射性反義寡核苷酸(Radiolabeled AODN)是將反義寡核苷酸(AODN)的基因靶向性和反基因作用與放射性核素的放射治療作用相結(jié)合的產(chǎn)物。本研究通過體外原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞，建立血管嚴(yán)滑肌的體外增殖模型；采用~(32)P標(biāo)記PDGFR-β反義寡核苷酸，觀察~(32)P標(biāo)記反義寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的作用部位、對血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期、目的基因表達、增殖、遷移和凋亡的影響，為血管術(shù)后再狹窄的防治提供新的方法。 材料和方法 蘇·軍出上甘碩士甘位十式 體外分離的4周齡Sprague－Dawley大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞，建立體外 增殖模型。人工合成的三段不同序列 PDGFR－p反義寡核百酸 AODN’門） 5·WCACTCCTGGAAGCCC3、AODN’（靶位421）STCTGAGCAC TAAAGCTGG3（靶位22．39）、AODN‘（靶位12．27）SAAGCCCTCTGAG CAC3”，正義寡核昔酸 5 GGG CTT CCA GGA GTG ATA3及f音義寡核百酸 5 GTG ATA GTA TGC CGA GCA3 所有寡核昔酸均經(jīng)全硫代修飾。通過觀 察各種寡核百酸對血管平滑肌細(xì)胞增殖抑制率（MTT法廠細(xì)胞周期（流式 細(xì)胞儀）、遷移抑制率（Boyden s小室法）、目的基岡表達（免疫組織化學(xué) 染色法）等的影響，挑選出抑制效應(yīng)最強的片段序列。對該反義寡核百酸片 段進行‘中的標(biāo)記。利用激光共聚焦顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞對異硫氰酸熒光 素（FITC）標(biāo)記的反義寡核盲酸的攝取和胞內(nèi)定位，觀察”P標(biāo)記的反義寡 核谷酸對平滑肌細(xì)胞遷移的影響，生長抑制率，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡和目的 基因表達的影響。 結(jié)果 卜 培養(yǎng)液內(nèi)加入 FITC標(biāo)記的 AODN 24、48 ’J＼時后，井光分別位于胞 漿內(nèi)和胞核內(nèi)： 2．MTT法測定各組細(xì)胞的 MTT OD值發(fā)現(xiàn)，5 u mol／LPDGFR－p反 義寡核昔酸（AODN’）作用后的VSMC的增殖強度（0．12 fo．02） 明顯弱于空白對照組（0．34土0．03，P／0．OJ）、止義組（0．31 fo．02， P／0．OJ）和錯義組（0．30上0．03，Prp、oj人 以濃度為10umol／L的 PDGFR－p反義寡核昔酸干預(yù)VSMC48h后，處廠DNA合成前期 （口JGI）細(xì)胞數(shù)量和酉分比高于空白對照組（P＜0刀5）；PDGFR－6免 疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)以 5 u mol／L以上濃度 PDGFR－e反義寡核百酸 干預(yù)48h后VSMC各組胞膜染色強度明顯弱于主白對照組和其它組 上述所有抑制作用中，AODNI組抑制作川最強。 4 第。尊由上舍碩十甘健公久 3．反義寡核昔酸 10urnol／L（AODN’）組（門l士 1刀）加藥 36小時后， 被血小板衍化生長因子誘導(dǎo)遷移通過Boyden，s ，J＼室碳纖維素膜的細(xì) 胞數(shù)量少于空白對照組（70．2士 2．2，P O．05）、上義織（67．8土 2．0， Pf00））、錯義組（68．3土3．2，Pf00））、AODN’組（33二士1．7， Prp．05）和AODN’（40．3士2．9，P／0．05人該抑制作用片濃度和時 間依賴性：正義、錯義寡核昔酸和 SUUOI／L以卜濃度遷移抑制不明 顯（PA10j）o 4．加入 AODN‘后 24小時細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)＋j加i！i前無明顯改變， 48小時細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)較加藥前有明顯改變：加藥后24小時 TU’NEL染色各組未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，48小時后AODN‘絹細(xì)胞爬片染 色有較多凋亡陽性細(xì)胞出現(xiàn)。 5．以濃度為0．25 p CxZ．oumol／U的”P標(biāo)記PDGFR．日AODN’干預(yù) VSMC48h后，處于 DNA合成前期（GofGI）細(xì)胞數(shù)量和白分比高于空 白對照組（P＜0刀引和 2刀＜IT’IOI／L的 AODN’織（尸＜0．05）；PDGFR－ p免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)以 2．ournol／L（．25 u Ci似上濃度 PDGFR－ 日反義寡核昔酸干預(yù)48h后VSMC各組胞膜染色強度明顯弱于空白 對照組和其它組：＊＊T法測定各組細(xì)胞的＊＊TOD值發(fā)現(xiàn)，0二5 卜Cip刀Umol幾）H中標(biāo)記pDGFR－p反義寡核i酸作川48小時后的 VSMC的增殖強度（0．27土0．01）明顯弱于主白對照組（0．39土0．of， P CO．oj）及同濃度放射性正義組（0．33士 0．05，P fo．oj）和反義寡核 昔酸組（0．36f0．06，P／0．OJ）和”P－ATP組（0．34t0．09，P＜0．05）， 該抑制作用呈明顯的濃度依賴性。 6．加入 2刀umol／L（0．25 u Ci）AODN’24小時后細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu) 較加藥前有明顯改變；加藥48 ’J’時后2刀urnol／L AODN’（0．2
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R817

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2789758