本文關(guān)鍵詞：抗VEGF治療對新生血管纖維化的影響

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【摘要】：目的 觀察血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)單克隆抗體Bevacizumab對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium, RPE)ARPE-19和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響,以探討抗VEGF治療是否會影響新生血管纖維化。 方法 采用化學(xué)誘導(dǎo)法(CoCl2)建立低氧環(huán)境(終濃度200μM)；根據(jù)實驗需要設(shè)定不同培養(yǎng)條件,將ARPE-19細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞分為3組：①正常對照組：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。②低氧組(CoCl2):培養(yǎng)基中加入CoCl2,使終濃度為200μM。③低氧+Bevacizumab組(CoCl2+Bevacizumab):培養(yǎng)基中加入終濃度為200μM的CoCl2及終濃度為0.25mg/ml的Bevacizumab。在上述不同條件下培養(yǎng)6h,12h,24h和48h后收獲細(xì)胞和上清,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, Real-time PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測ARPE-19及HUVEC的結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)、堿性成纖維細(xì)胞因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β2(transfoming growth factor β2, TGF-β2)在不同時間點的基因及蛋白表達(dá)水平,Real-time PCR和免疫蛋白印跡法(Western blotting)檢測兩種細(xì)胞在上述各時間點基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases2, MMP-2)的基因及蛋白表達(dá)水平,分別比較ARPE-19和HUVEC在三種不同培養(yǎng)條件下CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2表達(dá)水平差異。 結(jié)果 在ARPE-19細(xì)胞中,正常對照組,低氧組以及低氧+Bevacizumab組在6h,12h,24h和48h四個時間點的CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2mRNA相對表達(dá)量如下①CTGF mRNA6h:1.008±0.049,2.539±0.051,4.716±0.130;12h:1.002±0.021,2.183±0.078,3.816±0.107;24h:1.010±0.127,1.849±0.120,3.330±0.141;48h:1.002±0.115,1.485±0.049,2.722±0.035;②bFGF mRNA6h:1.007±0.032,1.476±0.031,3.803±0.047;12h:1.004±0.172,1.561±0.041,3.534±0.028;24h:1.005±0.038,1.227±0.028,2.775±0.179;48h:1.001±0.116,0.965±0.112,2.722±0.060;(3)TGF-β2mRNA6h:1.016±0.078,3.461±0.214,4.636±0.077;12h:1.006±0.117,2.698±0.230,3.713±0.095;24h:1.007±0.163,2.196±0.217,3.048±0.198;48h:1.012±0.156,1.763±0.213,2.754±0.169;④MMP-2mRNA6h:1.013±0.091,1.998±0.117,2.717±0.103;12h:1.009±0.131,1.713±0.162,3.136±0.139;24h:1.021±0.092,1.879±0.117,3.486±0.196;48h:1.014±0.109,1.776±0.113,2.253±0.094。對CTGF、 bFGF、TGF-β2和MMP-2各時間點的mRNA相對表達(dá)量分析,低氧組均較正常對照組升高,低氧+Bevacizumab組與低氧組和正常對照組比較,表達(dá)量均增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P值均小于0.05。ARPE-19細(xì)胞中ELISA結(jié)果顯示四個時間點的CTGF、 bFGF和TGF-β2蛋白低氧組與正常對照組相比表達(dá)增加,低氧+Bevacizumab組與低氧組和正常對照組比較表達(dá)量均增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P值均小于0.05,所測蛋白濃度如下(單位pg/ml)①CTGF6h:31.865±5.395,76.612±5.305,121.044±6.121;12h:84.225±7.165,164.173±4.905,290.827±7.091;24h:119.613±7.887,199.14±7.133,335.957±4.960,48h:95.160±9.851,133.224±8.089,217.872±8.140。②bFGF6h:27.704±4.139,31.003±6.305,89.893±5.120;12h:51.262±6.653,73.997±7.057,171.306±7.914;24h:67.148±5.088,81.759±8.339,116.435±4.096;48h:53.882±7.108,42.192±6.897,104.214±8.105;③TGF-β26h:28.172±6.911,83.559±4.103,121.245±9.003;12h:53.96±5.131,129.203±6.639,191.712±8.106;24h:75.772±4.092,156.453±6.196,220.247±7.014;48h:42.077±6.109,70.344±7.094,117.391±.195。Western blot結(jié)果示在四個時間點上,低氧組ARPE-19細(xì)胞的MMP-2蛋白表達(dá)較正常對照組升高,,低氧+Bevacizumab組與低氧組和正常對照組相比表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P值均小于0.05。在HUVEC細(xì)胞中,正常對照組,低氧組以及低氧+Bevacizumab組在6h,12h,24h和48h四個時間點的CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2mRNA相對表達(dá)量如下①CTGF mRNA6h:1.016±0.072,1.579±0.076,2.915±0.070;12h:1.104±0.073,2.280±0.070,4.357±0.064;24h:1.044±0.092,1.734±0.109,3.177±0.065;48h:0.903±0.089,1.453±0.100,2.371±0.069;②bFGF mRNA6h:0.906±0.056,1.411±0172,3.601±0.084;12h:1.106±0.092,1.623±0.113,4.034±0.106;24h:1.065±0.072,1.333±0.064,3.132±0.080;48h:1.001±0.091,1.171±0.045,2.862±0.096;③TGF-p26h:0.901±0.099,2.964±0.102,3.169±0.057;12h:0.981±0.052,2.392±0.082,4.441±0.107;24h:1.019±0.104,2.026±0.070,3.112±0.102;48h:1.072±0.123,1.762±0.120,2.685±0.080;④MMP-2mRNA6h:1.033±0.086,2.097±0.083,2.597±0.101;12h:0.933±0.092,2.879±0.125,3.298±0.087;24h:1.010±0.085,2.003±0.098,2.397±0.088;48h:1.089±0.130,1.971±0.099,2.173±0.079。對CTGF、 bFGF、TGF-β2和MMP-2各時間點的mRNA相對表達(dá)量分析,低氧組均較正常對照組升高,低氧+Bevacizumab組與低氧組和正常對照組比較,表達(dá)量明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P值均小于0.05。HUVEC細(xì)胞中ELISA結(jié)果顯示四個時間點的CTGF、 bFGF和TGF-β2蛋白低氧組與正常對照組相比表達(dá)增加,低氧+Bevacizumab組與低氧組和正常對照組比較表達(dá)量也是增加的,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P值均小于0.05,各組蛋白濃度如下(單位pg/ml)①CTGF6h:25.716±5.042,36.218±4.309,76.069±6.069;12h:53.627±6.563,73.884±6.092,219.870±7.867;24h:79.618±4.873,101.451±7.104,156.523±4.516;48h:61.575±5.844,77.962±4.539,111.317±4.938;②bFGF6h:11.967±6.985,16.635±7.203,42.343±6.941;12h:23.126±5.098,28.626±8.943,80.562±4.757;24h:34.153±7.126,40.125±7.986,103.971±4.145;48h:18.268±6.108,21.112±9.097,45.429±7.861;③TGF-p26h:17.523±4.529,57.632±8.623,68.094±7.084;12h:31.581±3.983,76.225±8.095,99.113±8.957;24h:43.415±4.079,90.462±9.106,126.457±7.627;48h:26.947±5.126,41.665±7.516,67.413±8.112。Western blot結(jié)果示HUVEC細(xì)胞中四個時間點的MMP-2蛋白表達(dá)低氧組較正常對照組升高,低氧+Bevacizumab組與低氧組和正常對照組相比表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P值均小于0.05。 結(jié)論 在低氧環(huán)境下Bevacizumab可以上調(diào)ARPE-19及HUVEC的纖維化相關(guān)因子CTGF, bFGF, TGF-02,MMP-2等的表達(dá),因此,玻璃體腔注射Bevacizumab有可能加重組織纖維化而影響抗VEGF治療的效果,但這些與纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子之間的相互作用以及是否還有其他因子的參與如炎癥因子,都有待進(jìn)一步的探討和研究。
【關(guān)鍵詞】：Avastin 新生血管纖維化 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R722.1
【目錄】：

• 附件4-7
• 摘要7-11
• Abstract11-15
• 主要符號表15-16
• 引言16-18
• 第一章 實驗材料和方法18-33
• 1.1 實驗材料18-22
• 1.2 實驗方法22-33
• 第二章 實驗結(jié)果33-46
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)33-34
• 2.2 MTT法細(xì)胞活性檢測34-35
• 2.3 Realtime PCR法在基因水平檢測CTGF、bFGF、TGF-β_2和MMP-2表達(dá)35-40
• 2.4 酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)在蛋白水平檢測CTGF、bFGF、TGF-β_2的表達(dá)40-44
• 2.5 免疫印跡法(western blot)檢測MMP-2蛋白的表達(dá)44-46
• 第三章 討論46-48
• 第四章 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 綜述53-62
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果62-63
• 致謝63

【參考文獻(xiàn)】

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1 易偉華,魏銳利,蔡季平,李玉莉;血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β_1在眼眶海綿狀血管瘤的表達(dá)及意義[J];國際眼科雜志;2004年02期

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本文編號：972524