本文關(guān)鍵詞：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用

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【摘要】：肝癌是世界上最常見的五大惡性腫瘤之一，肝癌的死亡率占癌癥死亡率的第三位。手術(shù)治療目前是治療肝癌的有效方式，但對(duì)于癌轉(zhuǎn)移病人的治療效果有限。如果找到能夠具有抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移雙重功能的藥物，對(duì)于癌癥的早期治療以及配合手術(shù)治療的藥物治療將具有重要意義。已有研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate， EGCG)能抑制一些癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，故本實(shí)驗(yàn)選用具有高轉(zhuǎn)移性質(zhì)的人肝癌細(xì)胞HCCLM6作為體外模型，研究EGCG的體外抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、蛋白質(zhì)組學(xué)方面探討EGCG對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，并對(duì)其抑制作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究,為今后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供參考。 首先，本課題從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的角度檢測EGCG對(duì)人肝癌細(xì)胞HCCLM6和人正常肝細(xì)胞HL7702的抑制作用，并探討EGCG誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。MTT法檢測EGCG對(duì)HCCLM6細(xì)胞和HL7702細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測EGCG對(duì)HCCLM6細(xì)胞和HL7702細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期和線粒體膜電位的影響;Western-bloting檢測EGCG對(duì)HCCLM6細(xì)胞和HL7702細(xì)胞Bcl-2，NF-kB，Bax, P53,caspase-9，caspase-3和cytochrome-c蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示EGCG(10-100μg/ml)能顯著抑制HCCLM6細(xì)胞的增殖作用并呈一定的劑量依賴性；EGCG從80μg/ml開始對(duì)HL7702細(xì)胞有顯著抑制作用。EGCG（10，30μg/ml）可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HCCLM6凋亡，降低其線粒體膜電位，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期；EGCG（10，30μg/ml）不能誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞HL-7702的凋亡，對(duì)其線粒體膜電位和細(xì)胞周期也沒有明顯影響。該濃度下EGCG處理HCCLM6細(xì)胞后，Bcl-2和NF-kB蛋白表達(dá)顯著下降,Bax,P53,caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)顯著升高，cytochrome-c由線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放；但EGCG作用前后HL-7702細(xì)胞后這些蛋白的表達(dá)均無明顯影響。這些結(jié)果表明EGCG可以選擇性作用于肝癌細(xì)胞，同時(shí)不影響正常肝細(xì)胞的功能。EGCG主要通過線粒體途徑引起HCCLM6細(xì)胞凋亡。所以在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，，EGCG可以作為一個(gè)潛在的治療肝癌的藥物。 其次，本研究旨在檢測EGCG對(duì)HCCLM6細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，并探討EGCG抑制HCCLM6細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。用體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)MHCCLM6細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移行為，檢測EGCG對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響;用明膠酶譜法和RT-PCR法探討EGCG抑制HCCLM6細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制。遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGCG(5，10μg/ml）能顯著抑制HCCLM6細(xì)胞的侵襲和遷移；明膠酶譜法顯示EGCG(5，10，20μg/ml）能顯著抑制HCCLM6細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性；RT-PCR結(jié)果表明EGCG(10，20μg/ml）能顯著抑制HCCLM6細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的mRNA水平。推測MMP-2和MMP-9的活性的降低可能與EGCG抑制HCCLM6細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究顯示EGCG具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能，提示EGCG可能成為一個(gè)治療肝癌的潛在藥物。 最后，為進(jìn)一步探討EGCG對(duì)HCCLM6細(xì)胞的抑制作用機(jī)制，本課題采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對(duì)EGCG作用HCCLM6細(xì)胞前后進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了35個(gè)蛋白點(diǎn)在EGCG處理后發(fā)生可重復(fù)的顯著變化，其中11個(gè)蛋白點(diǎn)被上調(diào)，24個(gè)被下調(diào)。選4個(gè)變化明顯的差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF/MS分析，利用得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行肽指紋圖譜分析后，被鑒定為FUBP1, HSPB1, NPM和CH60。已有文獻(xiàn)報(bào)道這四種蛋白與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和凋亡有關(guān)，故推測EGCG通過下調(diào)FUBP1、HSPB1、CH60的表達(dá)、上調(diào)NPM的表達(dá)來引起HCCLM6細(xì)胞凋亡和（或）抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果印證了前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)EGCG對(duì)于肝癌細(xì)胞作用機(jī)制的推測。
【關(guān)鍵詞】：肝腫瘤 表沒食子兒茶素沒食子酸酯 凋亡 轉(zhuǎn)移 蛋白質(zhì)組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-14
• 第一部分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞凋亡功效的比較14-30
• 材料14-16
• 1 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 1.1 細(xì)胞株14
• 1.2 藥物與試劑14-15
• 1.3 器材15-16
• 方法16-21
• 2 實(shí)驗(yàn)方法16-21
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)16
• 2.2 MTT 法檢測 EGCG 對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用16-17
• 2.3 細(xì)胞核形態(tài)的觀察17
• 2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期17-18
• 2.5 細(xì)胞凋亡測定18-19
• 2.6 線粒體膜電位的測定19
• 2.7 Western-blotting 測蛋白表達(dá)19-20
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析20-21
• 結(jié)果21-27
• 討論27-29
• 小結(jié)29-30
• 第二部分 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對(duì)人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用30-42
• 材料30-31
• 1 實(shí)驗(yàn)材料30-31
• 1.1 細(xì)胞株30
• 1.2 試劑30
• 1.3 器材30-31
• 方法31-36
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-36
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)31
• 2.2 侵襲實(shí)驗(yàn)31
• 2.3 遷移實(shí)驗(yàn)31-32
• 2.4 明膠酶譜法測金屬蛋白酶的活性32
• 2.5 RT- P C R32-34
• 2.6 免疫熒光技術(shù)檢測肝癌細(xì)胞 VEGF 和 OPN 的表達(dá)34-35
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析35-36
• 結(jié)果36-40
• 討論40-41
• 小結(jié)41-42
• 第三部分 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對(duì)人肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的影響42-49
• 材料42-43
• 1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 1.1 細(xì)胞株42
• 1.2 藥物與試劑42
• 1.3 器材42-43
• 方法43-45
• 2 實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)43
• 2.2 分組43
• 2.3 細(xì)胞全蛋白樣品制備43
• 2.4 蛋白濃度測定43
• 2.5 蛋白質(zhì)的純化43
• 2.6 等電聚焦電泳43-44
• 2.7 SDS-PAGE 電泳44
• 2.8 凝膠的銀染44
• 2.9 凝膠圖像的分析44
• 2.10 質(zhì)譜分析44-45
• 結(jié)果45-47
• 討論47-48
• 小結(jié)48-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 綜述55-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 附錄63-64
• 致謝64-65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：796678