本文關鍵詞：mTOR通路調控早產鼠肺成纖維細胞在氧化細胞損傷和修復中的作用及機制

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【摘要】：目的研究不同濃度及時間氧暴露后早產鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡情況;進一步探究雷帕霉素干預后不同濃度及時間氧暴露后早產鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡情況;研究小RNA干擾后早產鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡情況,同時分析其對mTOR通路上下游主要分子的基因和蛋白表達情況;進一步探究高體積分數(shù)氧、雷帕霉素及小RNA干擾對細胞外基質各膠原、凋亡相關基因和促纖維化因子的蛋白表達影響。方法實驗對象為早產小鼠肺成纖維細胞即L929細胞。將新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞于21%,40%,60%,90%的氧濃度暴露3、7、14天后,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、數(shù)目變化,Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測細胞凋亡,MTT法評估細胞增殖;將含有10n M雷帕霉素的新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞于21%,40%,60%,90%的氧濃度暴露3、7、14天后,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、數(shù)目變化,Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測細胞凋亡,MTT法評估細胞增殖;通過小RNA干擾將細胞分為轉染組和未轉染對照組,應用MTT法評估兩組細胞的增殖情況,Annexin V-FITC和PI雙染色法檢測兩組細胞的凋亡情況,應用Western blot法檢測mTOR通路上下游主要分子mTOR、4EBP1、P70S6K的蛋白表達情況,應用RT-PCR檢測mTOR通路上下游主要分子mTORC1、4EBP1、P70S6K的基因水平,了解早產鼠肺成纖維細胞在氧化性細胞損傷和修復中的作用及mtor信號通路機制;將細胞分為90%氧濃度組、轉染組、90%氧濃度+雷帕霉素組和對照組,應用elisa法檢測細胞外基質Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的水平,應用westernblot法檢測凋亡相關基因bcl-2和p53的蛋白表達情況,應用westernblot法檢測促纖維化因子ctgf和tgf-β的蛋白表達水平。結果1.高濃度氧干預的結果:a.高氧暴露后l929細胞增殖活性減弱,且隨著氧濃度和氧暴露時間的延長l929細胞增殖活性減弱越明顯,與空氣對照組比較具統(tǒng)計學差異(p0.05);高氧暴露后抑制細胞增殖,抑制率隨氧濃度和暴露時間延長而增加。b.高氧暴露后加速l929細胞凋亡壞死,隨著氧濃度和氧暴露時間的延長l929細胞凋亡率增加,與空氣對照組比較具統(tǒng)計學差異(p0.05)。c.高氧暴露后細胞胞體折光率降低,胞漿內顆粒物質增多,細胞生長不均勻,狀態(tài)欠佳,細胞數(shù)量隨氧濃度和氧暴露時間的延長而減少。2.雷帕霉素和高濃度氧共同干預后的結果:a.雷帕霉素和高濃度氧共同干預后l929細胞增殖活性明顯減弱,且隨著氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長l929細胞增殖活性減弱越明顯,與空氣+雷帕霉素組比較具顯著性差異(p0.01);60%的高氧暴露后增殖抑制更明顯;雷帕霉素和高濃度氧共同干預后可抑制細胞增殖,其抑制率隨氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長而增加。b.雷帕霉素和高濃度氧共同干預后加速l929細胞凋亡壞死,隨著氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長l929細胞凋亡率增加,與空氣對照組比較具統(tǒng)計學差異(p0.05)。c.雷帕霉素和高濃度氧共同干預后細胞胞體折光率降低,胞漿內顆粒物質增多,細胞生長不均勻,狀態(tài)欠佳,細胞數(shù)量隨氧濃度、雷帕霉素和氧作用時間的延長而減少。3.mtorsirna干擾對l929細胞增殖、凋亡及mtor信號通路上下游分子的蛋白和mrna表達結果:a.mtorsirna干擾后轉染組mtorc1、p70s6k和4ebp1的蛋白表達下降,與非轉染組比較有顯著性差異(p0.01)。b.mtorsirna干擾后轉染組mtorc1、p70s6k和4ebp1的mrna表達下降,與非轉染組比較有顯著性差異(p0.01)。c.mtorsirna干擾后轉染組l929細胞增殖活性減弱,與非轉染組比較有顯著性差異(p0.01);mtorsirna干擾后抑制l929細胞增殖,其抑制率為26.71%。d.mtorsirna干擾后可加速l929細胞凋亡,與與非轉染組比較有顯著性差異(p0.01)。4.高濃度氧、雷帕霉素及mtorsirna干預對l929細胞外基質影響的結果:a.與空氣對照相比,90%高氧組、90%高氧+雷帕霉素組肺成纖維細胞的細胞外基質中col-Ⅰ、col-Ⅲ和fn均有升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);與空氣對照組相比,轉染組的col-Ⅰ、col-Ⅲ和fn均下降,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。b.與空氣對照相比,90%高氧組、90%高氧+雷帕霉素組、轉染組肺成纖維細胞的bcl-2蛋白表達減少,p53蛋白表達增加,差異有顯著性(p0.01)。c.與空氣對照組相比,90%高氧組、90%高氧+雷帕霉素組的ctgf和tgf-β蛋白表達均升高,轉染組的ctgf和tgf-β蛋白表達均下降,差異有顯著性(p0.01);結論1.單純高濃度氧作用于體外培養(yǎng)的早產鼠肺成纖維細胞時,可抑制其增殖,加速凋亡。2.雷帕霉素可抑制早產鼠肺成纖維細胞增殖,加速凋亡,其可能的機制是通過mTOR信號通路。3.mTORsiRNA可抑制早產鼠肺成纖維細胞增殖,加速凋亡。4.雷帕霉素、mTORsiRNA抑制早產鼠肺成纖維細胞增殖的可能機制是通過mTOR信號通路,特異性地抑制早產鼠肺成纖維細胞中mTORC1、4EBP1和P70S6K蛋白及mRNA的表達。5.90%濃度高氧、雷帕霉素均可促進高氧暴露后早產小鼠肺成纖維細胞的col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN增多,阻斷其增多的可能機制是通過mTOR信號通路的調節(jié)。6.Bcl-2是抗凋亡因子,可抑制肺成纖維細胞凋亡;P53是促凋亡因子,可促進肺成纖維細胞凋亡。90%濃度高氧、雷帕霉素、mTORsiRNA轉染均可促進肺成纖維細胞凋亡。7.CTGF和TGF-β在氧化細胞損傷BPD肺纖維化時促纖維化作用的可能機制是通過mTOR信號通路,即mTOR信號通路通過促進CTGF和TGF-β的表達促進早產鼠肺成纖維細胞過度增殖參與BPD的修復過程。8.TGF-β和CTGF均為促纖維化因子,同時CTGF是TGF-β下游的生物學作用相對特異的促纖維化因子,可能是BPD肺纖維化的重要靶點。
【關鍵詞】：肺成纖維細胞 mTOR信號通路 雷帕霉素 小RNA干擾技術 增殖和分化
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R722.6
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-16
• 英漢縮略語名詞對照16-18
• 第1章 緒論18-22
• 第2章 不同濃度及時間氧暴露對早產鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡壞死的影響22-34
• 2.1 材料22
• 2.2 方法22-26
• 2.3 結果26-31
• 2.4 討論31-34
• 第3章 雷帕霉素對不同濃度及時間氧暴露對早產鼠肺成纖維細胞增殖和凋亡壞死的影響34-46
• 3.1 材料34
• 3.2 方法34-36
• 3.3 結果36-43
• 3.4 討論43-46
• 第4章 mTORsiRNA干擾對不同濃度及時間氧暴露后早產鼠肺成纖維細胞增殖、壞死和mTOR信號通路的影響46-64
• 4.1 材料46-48
• 4.2 方法48-57
• 4.3 結果57-62
• 4.4 討論62-64
• 第5章 高濃度氧、雷帕霉素和mTORsiRNA干擾對早產鼠肺成纖維細胞的細胞外基質的影響64-76
• 5.1 材料64-65
• 5.2 方法65-69
• 5.3 結果69-72
• 5.4 討論72-76
• 第6章 結論76-78
• 參考文獻78-84
• 文獻綜述84-93
• 參考文獻90-93
• 攻讀碩士專業(yè)學位期間的科研成果93
• 致謝93

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