本文關(guān)鍵詞：HRE調(diào)控VEGF表達(dá)轉(zhuǎn)染NSCs的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的：獲得表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因工程神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells, NSCs),研究缺氧反應(yīng)元件(hypoxia-reponsive element, HRE)在缺氧條件下是否能提高VEGF基因的表達(dá),以期為缺氧缺血性腦損傷尋求一種安全、高效的基因治療方法。 方法：分離胎齡14天的SD大鼠胚胎前腦皮質(zhì),采用無(wú)血清培養(yǎng)的方法獲得細(xì)胞克隆,應(yīng)用間接免疫熒光法鑒定NSCs和分化的神經(jīng)細(xì)胞。構(gòu)建攜帶VEGF165基因的兩種重組慢病毒載體pGC-FU-VEGF165,及9HRE-pGC-FU-VEGF165,將兩者分別轉(zhuǎn)染NSCs細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后的NSCs分為7組：A組為轉(zhuǎn)染pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞、B1組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞,B2組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于缺氧條件下培養(yǎng)6h的神經(jīng)干細(xì)胞,B3組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于缺氧條件下培養(yǎng)12h的神經(jīng)干細(xì)胞,B4組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于缺氧條件下培養(yǎng)24h的神經(jīng)干細(xì)胞,C組為轉(zhuǎn)染空載體慢病毒于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞,D組為未轉(zhuǎn)染慢病毒于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞作為的空白對(duì)照組,(常氧條件為95%02+5%C02；缺氧條件為2%02+98%N2)；熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率,采用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因NSCs的VEGF基因表達(dá)水平,Western-blot及Elisa檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分泌型血管內(nèi)皮生長(zhǎng)蛋白的表達(dá)水平,MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NSCs的增殖活性。 結(jié)果： ①離體培養(yǎng)的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞呈Nestin陽(yáng)性； ②經(jīng)測(cè)序兩組目的基因與GenBbank中序列完全一致,成功構(gòu)建HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒、pGC-FU-VEGF165慢病毒載體； ③將慢病毒轉(zhuǎn)染至神經(jīng)干細(xì)胞分組后在熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)A組、B2組、B3組、B4組、C組基因工程神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,B1組、D組未見(jiàn)綠色熒光；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)A組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率50%左右,B2組、B3組、B4組、C組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為80%左右,B1組、D組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為0.49%左右； ④RT-PCR檢測(cè)C組、D組、B1組細(xì)胞無(wú)明顯VEGFmRNA表達(dá),B2組、B3組、B4組、A組細(xì)胞均表達(dá)VEGFmRNA,B2組、B3組、B4組細(xì)胞、/EGFmRNA表達(dá)量顯著高于A組(P0.05),且B組內(nèi)細(xì)胞隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)VEGFmRNA表達(dá)量增高(P0.05)； ⑤Western-blot檢測(cè)C組、D組、B1組無(wú)明顯VEGF蛋白表達(dá),B2組、B3組、B4組、A組細(xì)胞均表達(dá)VEGF蛋白,B2組、B3組、B4組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量高于A組(P0.05),且B組內(nèi)細(xì)胞隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)VEGF蛋白表達(dá)量增高(P0.05)； ⑥Elisa檢測(cè)C組、D組、B1組無(wú)明顯分泌型VEGF蛋白表達(dá),B2組、B3組、B4組、A組細(xì)胞可表達(dá)分泌型VEGF蛋白,B2組、B3組、B4組細(xì)胞分泌型VEGF蛋白表達(dá)量高于A組(P0.05),且B組內(nèi)細(xì)胞隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)分泌型、/EGF蛋白表達(dá)量增高(P0.05)； ⑦M(jìn)TT檢測(cè)示C組、D組細(xì)胞增殖活性無(wú)差異(P0.05),A組、B2組細(xì)胞增殖活性均高于與C組、D組(P0.05),B2組細(xì)胞增殖活性高于A組(P0.05)。 結(jié)論：成功構(gòu)建具有缺氧誘導(dǎo)特性的高表達(dá)VEGF的基因工程N(yùn)SCs,證明NSCs-VEGF基因工程干細(xì)胞可分泌活性VEGF蛋白,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖,在缺氧時(shí)受HRE啟動(dòng)子作用,能提高VEGF基因的表達(dá),隨缺氧時(shí)間的改變HRE可對(duì)VEGF表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控,為缺血缺氧性腦損傷實(shí)現(xiàn)安全、高效的基因治療方法提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)干細(xì)胞 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 缺氧反應(yīng)元件 轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R722.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文~.略詞簡(jiǎn)表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定14-21
• 1.1 材料14-16
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備14
• 1.1.3 主要試劑14-15
• 1.1.4 主要試劑的配制15
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)器材的預(yù)處理15-16
• 1.2 方法16-18
• 1.2.1 胎鼠NSCs的原代培養(yǎng)16
• 1.2.2 NSCs的傳代培養(yǎng)16-17
• 1.2.3 NSCs體外誘導(dǎo)分化17
• 1.2.4 間接免疫熒光法鑒定NSCs17-18
• 1.3 結(jié)果18-19
• 1.3.1 原代NSCs生長(zhǎng)情況18
• 1.3.2 NSCs體外誘導(dǎo)分化18-19
• 1.3.3 間接免疫熒光法鑒定NSCs19
• 1.4 討論19-20
• 1.4.1 神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)的條件及生長(zhǎng)情況19
• 1.4.2 神經(jīng)細(xì)胞的鑒定19-20
• 1.5 小結(jié)20-21
• 第二部分 HRE調(diào)控VEGF表達(dá)轉(zhuǎn)染NSCs的實(shí)驗(yàn)研究21-36
• 2.1 材料22-25
• 2.1.1 細(xì)胞22
• 2.1.2 主要儀器22
• 2.1.3 主要試劑及耗材22
• 2.1.4 主要試劑的配制22-25
• 2.2 方法25-31
• 2.2.1 pGC-FU-VEGF165重組慢病毒、HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒構(gòu)建25
• 2.2.2 慢病毒感染目的細(xì)胞25-26
• 2.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率26-27
• 2.2.4 PCR檢測(cè)VEGFmRNA含量27-29
• 2.2.5 Western-Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外VEGF165蛋白表達(dá)29-30
• 2.2.6 ELISA檢測(cè)基因工程神經(jīng)干細(xì)胞分泌型VEGF蛋白表達(dá)30
• 2.2.7 MTT檢測(cè)基因工程神經(jīng)干細(xì)胞增殖30-31
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法31
• 2.4 結(jié)果31-33
• 2.4.1 pGC-FU-VEGF 165重組慢病毒、HRE-pGC-FU-VEGF 165重組慢病毒質(zhì)粒鑒定31
• 2.4.2 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞31
• 2.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率31
• 2.4.4 RT-PCR檢測(cè)各組目的基因VEGF165在NSCs細(xì)胞中的表達(dá)31-32
• 2.4.5 Western blot檢測(cè)VEGF165蛋白在NSCs細(xì)胞中的表達(dá)水平32
• 2.4.6 ELISA檢測(cè)各組轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞分泌型VEGF蛋白表達(dá)32
• 2.4.7 MTT法檢測(cè)基因修飾的NSCs增殖活性32-33
• 2.5 討論33-34
• 2.5.1 目的基因的選擇33
• 2.5.2 HRE啟動(dòng)子的選擇及其對(duì)目的基因VEGF的調(diào)控作用33-34
• 2.6 小結(jié)34-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 附圖41-51
• 綜述51-59
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 致謝59

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 徐磊;張凱倫;謝艾妮;夏家紅;;低氧反應(yīng)元件對(duì)大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因的調(diào)控作用[J];臨床心血管病雜志;2007年06期

2 屈素清;欒佐;劉衛(wèi)鵬;席小輝;汪兆艷;;人神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦性癱瘓并重度視覺(jué)障礙患兒的療效[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2009年10期

3 王東;張建軍;馬景擰;;神經(jīng)干細(xì)胞NgR基因沉默立體定向移植治療大鼠腦損傷[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年14期

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本文編號(hào)：727256