本文關(guān)鍵詞：不同時(shí)期終絲和生長因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化的影響

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【摘要】：引言 先天性脊髓病變是嚴(yán)重影響患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一類疾病,這類疾病包括脊髓拴系綜合征(Tethered cord syndrome,TCS),脊髓縱裂(Split cord malformation, SCM),脊髓脊膜膨出(Myelomeningocele)等疾病。在上述疾病中尤其以脊髓拴系綜合征(TCS)對(duì)患兒生長發(fā)育影響較大,TCS是由于終絲病變彈性降低,對(duì)脊髓圓錐末端產(chǎn)生持續(xù)牽拉作用,導(dǎo)致脊髓局部缺血缺氧改變,造成脊髓組織的神經(jīng)元細(xì)胞線粒體氧化磷酸化功能障礙,導(dǎo)致神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)功能受損,逐漸出現(xiàn)雙下肢感覺運(yùn)動(dòng)障礙,雙足畸形,大小便功能障礙等一系列神經(jīng)損害臨床表現(xiàn)的一種疾病。目前對(duì)于TCS主要治療方式為病變終絲的切除和對(duì)脊髓圓錐末端粘連組織的松解,以達(dá)到對(duì)脊髓圓錐末尾端的充分松解,使其逐漸恢復(fù)到正常水平,進(jìn)而終止或改善已出現(xiàn)的臨床癥狀。但是目前這種治療方式術(shù)后的效果并不理想。1992年Reynolds等從小鼠大腦組織(紋狀體)中分離出在體外可以不斷分裂增殖更新,具有向神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的多潛能的細(xì)胞群,提出了神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的概念。NSCs概念的提出使人們改變了以往認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞是永久性細(xì)胞,損傷后不可再生的觀念,為中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和功能恢復(fù)帶來了新的希望,同時(shí)也為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一種新的治療策略神經(jīng)干細(xì)胞移植。以往對(duì)于脊髓中NSCs的研究認(rèn)為其只存在于脊髓室管膜下,終絲組織不存在NSCs,對(duì)終絲組織的認(rèn)識(shí)只是將其看作是從脊髓末端向下延續(xù)穿出硬脊膜連接尾骨的一結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的纖維血管復(fù)合物,但Varghese等分別在2009年和2010年利用人體終絲組織培養(yǎng)出具有NSCs增殖分化特點(diǎn)的細(xì)胞群,證明終絲組織中有NSCs的存在。這一發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)于NSCs的認(rèn)識(shí)又一次改變。目前國內(nèi)對(duì)于終絲組織中NSCs研究未見有文獻(xiàn)報(bào)道,此次實(shí)驗(yàn)利用胎兒終絲組織進(jìn)行了NSCs的分離培養(yǎng)及鑒定的初步研究,這為終絲中NSCs的分離培養(yǎng)提供了一定的參考。 目的 1、通過原代懸浮培養(yǎng)的方法對(duì)胎兒終絲組織中NSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)并對(duì)培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行Nestin鑒定,表達(dá)陽性者為NSCs,從而證明終絲組織中存在NSCs。 2、通過對(duì)不同胎齡終絲及TCS患兒的病變終絲進(jìn)行NSCs的分離培養(yǎng)來比較不同終絲組織中NSCs的增長和分化的特點(diǎn)。 3、通過對(duì)胎兒終絲組織中NSCs的體外分離培養(yǎng)的觀察,分析表皮生長因子(EGF)、成纖維生長因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)對(duì)NSCs增長及分化的影響。 材料和方法 1.收集2011.11-2012.8鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科12-28W流產(chǎn)胎兒15例,按胎齡大小分為3組：A組(12-17W),B組(18-23W),C組(24-28W),取胎兒終絲組織進(jìn)行NSCs的原代分離培養(yǎng),培養(yǎng)過程中用倒置顯微鏡定期觀察NSCs的生長情況,計(jì)數(shù)神經(jīng)球的數(shù)目比較三組胎兒終絲中NSCs的生長特點(diǎn)。取一定數(shù)量的NSCs進(jìn)行Nestin鑒定,表達(dá)陽性者為NSCs,從而證實(shí)終絲組織中存在NSCs。 2.收集12-20W胎齡新鮮流產(chǎn)胎兒9例,根據(jù)在NSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12中添加物不同分為3組：A組(DMEM/F12+B27+EGF+bFGF),B組(DMEM/F12+B27+EGF+bFGF+LIF),C組(DMEM/F12+B27)為對(duì)照組,觀察三組NSCs生長情況,之后用胎牛血清進(jìn)行誘導(dǎo)分化,用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法鑒定上述三組NSCs誘導(dǎo)分化后NSE和GFAP的分化比例,分析EGF、bFGF和LIF對(duì)NSCs增長和分化的影響。 3.收集2011.9-2012.5鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院小兒骨科收治的5例TCS患兒的術(shù)中切除的病變終絲,術(shù)前與家屬溝通后征得其同意,上報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,通過觀察病變和正常終絲組織中NSCs增長和分化的情況,比較不同類型終絲組織中NSCs的分離培養(yǎng)和分化的特點(diǎn)。 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,三組間NSCs數(shù)目、NSE和GFAP比例的比較采用單因素方差分析,組間NSCs數(shù)目、NSE和GFAP比例的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 1.對(duì)終絲中分離培養(yǎng)出的細(xì)胞在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)其具有NSCs形態(tài)特點(diǎn),將培養(yǎng)出的細(xì)胞經(jīng)Nestin鑒定其表達(dá)為陽性,說明培養(yǎng)出來的細(xì)胞為NSCs. 2.不同胎齡終絲組織中培養(yǎng)出的NSCs數(shù)量不同,對(duì)三組結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(P0.05),提示不同胎齡的終絲樣本NSCs增長數(shù)目有顯著性差異。對(duì)三組的NSCs數(shù)量進(jìn)行兩兩比較,A組和B組比較P0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組和C組比較、B組和C組比較,P均小于0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.不同添加物組中NSCs增長和分化存在差異,對(duì)三組結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(P(0.05),提示用含不同細(xì)胞因子的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)NSCs,在增長數(shù)目、NSE和GFAP陽性細(xì)胞百分比方面均有顯著性差異。在NSCs數(shù)目方面：三組兩兩比較P均小于0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在NSCs分化方面：三組兩兩比較P均小于0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.不同類型終絲組織中NSCs增長和分化存在差異,對(duì)二者差異進(jìn)行單因素方差分析,P均小于0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示采用不同類型的終絲樣本分離培養(yǎng)NSCs在增長和分化方面均有顯著性差異。 結(jié)論 1.終絲組織在特定條件下可在體外分離培養(yǎng)出NSCs,胎齡大小與終絲組織中NSCs的數(shù)量有密切的關(guān)系,這可能與胎齡較小者NSCs的增長潛能較大有關(guān)。 2.不同的因子對(duì)終絲組織中NSCs的增長和分化有一定的影響,LIF在促進(jìn)NSCs增長和抑制其分化方面作用較EGF和bFGF明顯。 3.病變終絲與正常終絲均可以培養(yǎng)出NSCs,正常終絲組神經(jīng)球的增長數(shù)量和分化后NSE所占的比例較病變終絲組明顯增高,胎兒正常終絲組織更適宜作為NSCs的體外分離培養(yǎng)的組織來源。
【關(guān)鍵詞】：終絲 神經(jīng)干細(xì)胞 EGF bFGF UF
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R726.8
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-12
• 目錄12-13
• 中英文縮略詞對(duì)照表13-14
• 引言14-16
• 材料和方法16-22
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-26
• 討論26-32
• 結(jié)論32-33
• 附圖33-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 綜述40-54
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷54
• 碩士研究生期間發(fā)表的論文及獲得獎(jiǎng)項(xiàng)54-55
• 致謝55

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：614101