本文關(guān)鍵詞：TGF-β1誘導(dǎo)的BMSCs對(duì)髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良髖臼軟骨細(xì)胞分化的影響

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【摘要】：[背景及目的]發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良是小兒骨科最常見(jiàn)的下肢畸形。沒(méi)有經(jīng)過(guò)治療的髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良或者閉合復(fù)位后的殘余髖臼發(fā)育不良,會(huì)在早期就發(fā)生髖臼軟骨發(fā)育停滯及退行性變,晚期容易出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎,大多數(shù)最終需要全髖關(guān)節(jié)置換術(shù),嚴(yán)重影響這些病人的生活質(zhì)量。近年來(lái)軟骨組織工程學(xué)的研究和應(yīng)用為關(guān)節(jié)退行性變、創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎等引起的骨軟骨缺失的修復(fù)提供了方向。大量研究表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p1能調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞聚集并誘導(dǎo)軟骨形成,其下游作用因子Sox9被認(rèn)為是軟骨形成及軟骨形態(tài)功能維持最主要的因子。應(yīng)用TGF-β1可誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化,細(xì)胞外基質(zhì)主要成分膠原Ⅱ及糖胺聚糖等表達(dá)增加。但將其應(yīng)用在早期DDH髖臼軟骨損傷修復(fù)中研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上,擬利用TGF-β1誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與DDH髖臼軟骨細(xì)胞共培養(yǎng),為DDH髖臼軟骨細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子,探討其對(duì)發(fā)育不良髖臼軟骨細(xì)胞向正常軟骨分化并表達(dá)分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的作用。為下一步將BMSCs置入支架培養(yǎng),并植入髖臼發(fā)育不良的軟骨組織,促進(jìn)DDH軟骨發(fā)育,為DDH引起的軟骨損害提供應(yīng)用軟骨組織工程學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]1.DDH動(dòng)物模型的建立及髖臼軟骨細(xì)胞的獲取1.1依據(jù)前期課題組DDH造模方法,對(duì)20只新生SD大鼠雙髖雙膝醫(yī)用膠帶并攏模擬襁褓體位固定7天作為DDH組。20只未作處理的新生SD大鼠作為正常對(duì)照組。1.2 8日齡時(shí)分別過(guò)量麻醉處死DDH組及正常組大鼠,無(wú)菌條件下取雙側(cè)髖關(guān)節(jié),DDH組棄去造模未成功髖關(guān)節(jié)。分別取4只造模成功和4只正常髖關(guān)節(jié)做HE染色。余髖關(guān)節(jié)取髖臼軟骨消化后獲得髖臼軟骨細(xì)胞。2. BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定2.1取10只4周齡SD大鼠,過(guò)量麻醉致死,去雙側(cè)股骨及脛骨,DMEM沖洗,全骨髓培養(yǎng)法獲得BMSCs.2.2第三代BMSCs采用流式細(xì)胞儀鑒定CD3、CD90及CD29的陽(yáng)性率。3.共培養(yǎng)體系的建立及BMP-2的測(cè)定3.1直接共培養(yǎng)體系建立：將DDH髖臼軟骨細(xì)胞(DACs)、正常髖臼軟骨細(xì)胞(NACs)分別與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行直接共培養(yǎng),各種細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照組；根據(jù)加入TGF-p1濃度的不同(0、10 ng/m1),每組再分為2個(gè)小組共10個(gè)小組,每組3個(gè)培養(yǎng)孔。3.2Transwell間接共培養(yǎng)體系建立：按直接共培養(yǎng)體系進(jìn)行分組,在共培養(yǎng)分組中,將DACs或NACs加入transwell上室中,等量BMSCs加入transwell下室中。3.3共培養(yǎng)體系建立后,觀察細(xì)胞形態(tài)改變,分別于共培養(yǎng)第三天或第三天、第七天收集各孔上清液,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)測(cè)BMP-2含量。4.SPSS16.0統(tǒng)計(jì)和比較組間差異I結(jié)果]1.實(shí)驗(yàn)組20只SD大鼠發(fā)生DDH18只,建模成功率90%。大體可見(jiàn)：雙側(cè)髖關(guān)節(jié)外上方髖臼軟骨淺平、肥大,軟組織嵌入。HE染色可見(jiàn)DDH髖臼軟骨存在組織裂隙,軟骨細(xì)胞排列不均一。提示DDH髖臼軟骨發(fā)育停滯,髖臼軟骨細(xì)胞去分化改變。2.4周齡SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第三代流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果：98.5%的第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD29(+)+CD90(+)+CD34(一),提示第三代BMSCs純度可達(dá)98.5%。3.單獨(dú)培養(yǎng)的DDH髖臼軟骨細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞分布不均勻,培養(yǎng)至第七天未見(jiàn)明顯肥大的軟骨細(xì)胞,提示DDH髖臼軟骨細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)呈去分化改變。在與BMSCs進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)并在TGF-β1存在條件下,DDH髖臼軟骨細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形,且在共培養(yǎng)第三天出現(xiàn)中心肥大軟骨細(xì)胞的出現(xiàn),而未加入TGF-β1共培養(yǎng)體系中未觀察到該形態(tài)學(xué)改變。4.直接共培養(yǎng)第3天測(cè)BMP-2水平,正常組BMP-2水平明顯高于DDH組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入TGF-β1后,DDH組BMP-2水平明顯高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在Transwell共培養(yǎng)第七天,獲得類(lèi)似結(jié)果。[結(jié)論]1、DDH模型早期髖臼軟骨表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)由圓形變?yōu)樗笮?細(xì)胞基質(zhì)中出現(xiàn)大量裂隙；DDH髖臼軟骨細(xì)胞呈去分化改變。2、單純BMSCs可能促進(jìn)正常髖臼軟骨細(xì)胞分化,但不能促進(jìn)DDH髖臼軟骨細(xì)胞的分化。進(jìn)而提示BMSCs需要額外的刺激因子共同作用以促進(jìn)DDH髖臼軟骨細(xì)胞的分化。3、與TGF-β1誘導(dǎo)的BMSCs共培養(yǎng),DDH髖臼軟骨細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變成圓形,出現(xiàn)細(xì)胞聚集及中心細(xì)胞肥大趨勢(shì),上清液BMP-2的分泌增高。提示TGF-β1誘導(dǎo)的BMSC能促進(jìn)DDH髖臼軟骨細(xì)胞的分化成熟4、直接的細(xì)胞接觸可以促進(jìn)單純BMSCs或TGF-β1誘導(dǎo)的BMSCs對(duì)正�；駾DH髖臼軟骨細(xì)胞分化的影響。從而提示,TGF-β1誘導(dǎo)的BMSCs與DDH髖臼軟骨細(xì)胞直接接觸,可以更為有效的促進(jìn)DDH髖臼軟骨細(xì)胞分化成熟。
【關(guān)鍵詞】：發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良 軟骨細(xì)胞 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 細(xì)胞共培養(yǎng) 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R726.8
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 材料與方法14-20
• 結(jié)果20-32
• 討論32-36
• 結(jié)論36
• 實(shí)驗(yàn)不足及展望36-37
• 參考文獻(xiàn)37-42
• 綜述42-50
• References46-50
• 致謝50-51

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本文編號(hào)：548084