本文關(guān)鍵詞：利用外顯子測序方法探究TBX5與室間隔缺損之間的關(guān)系

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【摘要】：研究背景和目的.室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）定義為左、右心室的間隔上存在交通。VSD是最常見的先天性心臟畸形，總發(fā)病率約占先心病的40％。室間隔缺損可單獨發(fā)生，單純VSD在足月活產(chǎn)新生兒中的發(fā)病率約為2‰，約占先心病的20％。它也可與其他復(fù)雜畸形同時存在（如法洛氏四聯(lián)癥、功能性單心室、完全型大動脈轉(zhuǎn)位、糾正型大動脈轉(zhuǎn)位及主動脈縮窄等），影響患兒的生存質(zhì)量。由于對于正常心臟室間隔發(fā)育機制了解有限，VSD發(fā)病機理的知曉仍相當(dāng)局限。目前研究認為室間隔是由兩個組分形成：間質(zhì)化細胞成分和肌細胞成分，前者主要由圓錐隔和房室通道處的心內(nèi)膜墊融合而成，后者的組成機制仍存在爭論。部分學(xué)者認為肌部室間隔的形成是左、右心室室腔增大過程中，其交界處游離壁的小梁組織融合而成；有學(xué)者則認為肌部室間隔起源于原始室間隔處的一堆細胞簇，細胞簇可向心內(nèi)膜墊生長并形成肌部室間隔。不同的影響因素將造成不同部位的室間隔缺損。原始室間隔形成障礙將導(dǎo)致肌小梁部位的缺損；房室通道處心內(nèi)膜墊間的融合障礙會造成流入道部位的缺損；動脈流出道部位的心內(nèi)膜點發(fā)育異�？蓪�(dǎo)致流出道部位的缺損甚至對位不良型室間隔缺損；心內(nèi)膜墊與原發(fā)肌性室間隔間的融合障礙會導(dǎo)致膜部室間隔缺損。 TBX5基因從屬于TBX家族，定位于人類12號染色體長臂2區(qū)4帶1亞帶，其cDNA全長244lbp,有9個外顯子，編碼518個氨基酸。其中3－7號外顯子編碼T－BOX蛋白（含180氨基酸），是DNA結(jié)合并發(fā)揮功能的區(qū)域（T－Boxdomain）。 TBX5蛋白產(chǎn)物結(jié)構(gòu)在種屬間（斑馬魚，爬行類動物，小鼠，雞等）呈現(xiàn)高度的保守性，C端在轉(zhuǎn)錄活動過程中具有重要作用，基本都含有helix-span-helix二聚體區(qū)域和包括8個bp共有序列［(A/G)GGTGT (C/G/T)(A/G)］在內(nèi)的DNA結(jié)合區(qū)域，此外還含有一個核定位信號，這有利于我們研究這一心臟發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子。1997年，Basson等首次發(fā)現(xiàn)TBX5基因突變可造成心手綜合征（Holt-Oramsyndrome,HOS; MIM142900）一類以心臟間隔缺損（房間隔、室間隔缺損）為主并合并不同程度的上肢和指關(guān)節(jié)畸形為特征的先天性畸形。當(dāng)時研究認為TBX5的突變引起該基因表達量降低，即單倍劑量不足（haploinsufficiency），是導(dǎo)致HOS發(fā)生的主要原因。2003年Claudia等對2個ASD型HOS家系研究亦同樣發(fā)現(xiàn)，其存在TBX5的突變；同年，Stella等對68個間隔缺損的患兒血樣本進行測序發(fā)現(xiàn)9個TBX5突變（點突變和錯義突變）存在于房間隔缺損和房室間隔缺損中，但在室間隔缺損中并無發(fā)現(xiàn)任何突變；而在2009年，劉等人的研究發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中TBX5的突變和單純室間隔缺損有關(guān)，但具體致病機制并不明確。2012年Smemo等的研究提示TBX5基因非編碼區(qū)域增強子的變化引起單純室間隔缺損的表型，這提示了對TBX5在室間隔缺損發(fā)病機制中作用研究的新思路。目前，國內(nèi)對VSD和TBX5基因突變相關(guān)性研究相對較少。對VSD潛在致病基因TBX5及其作用機理進行深入研究將有助于遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，進而進行產(chǎn)前干預(yù)，提高患兒的存活率和生存質(zhì)量，并有可能在不久的將來將基因治療引入到先心病的防治中。這對于減輕家庭和社會沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，提高人口素質(zhì)具有重大的現(xiàn)實意義，符合《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020年）》提出的“將出生缺陷防治列為優(yōu)先主題”的政策。 方法.病例組為216例VSD患兒，男125例，女91例。平均年齡128±321天,平均體重8.7±3.5公斤。所有入組患者均經(jīng)二維超聲心動圖檢查明確存在室間隔缺損，，缺損平均大小為7.65±3.73mm；伴隨其他復(fù)雜先心病的患兒另行增強CT或心導(dǎo)管檢測。另以250名健康兒童為對照，對照組兒童均經(jīng)超聲心動圖檢查證實心內(nèi)結(jié)構(gòu)正常，平均年齡4.93±1.14歲，其中男性135例，女性115例。病例組與對照組間男女性別無顯著差異（P=0.57），病例組平均年齡（128±321天）小于對照組（4.93±1.14歲），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.001）。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。經(jīng)知情同意后采集外周靜脈血2ml，置于檸檬酸鈉抗凝管中，混勻后-80℃冰箱凍存?zhèn)溆�。�?yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）擴增TBX5基因的全部外顯子和外顯子兩側(cè)部分內(nèi)含子，并對擴增片段進行雙向測序。應(yīng)用BLAST程序?qū)⑺鶞yTBX5基因序列與GeneBank中的已知序列進行對比以檢測基因突變。 結(jié)果.基因分析顯示，在VSD組編碼蛋白區(qū)域中未發(fā)現(xiàn)影響所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的突變。識別出一個新的TBX5基因多態(tài)：c.663+36TC，即為TBX-5第6外顯子下游第36位胸腺嘧啶變?yōu)榘奏こ�。等位基因T、C及其構(gòu)成的3種基因型TT、TC、CC在VSD組和對照組間的頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（等位基因頻率比較：Z=－2.126，P0.001；基因型頻率比較：Z=－2.933，P=0.043）。結(jié)論.TBX5基因編碼區(qū)域的突變可能不是引起膜周／對位不良型室間隔缺損的主要原因，TBX5在心胚發(fā)育期間可能參與室間溝（interventricular groove）處肌小梁的形成、融合和增生，并對肌部室間隔的發(fā)育有重要作用。此外單純的散發(fā)VSD可能具有多元化的致病因素如基因間的共作用、非編碼區(qū)域調(diào)控序列的變化、基因－環(huán)境間的作用等；此外TBX5蛋白定位于細胞核內(nèi)的能力（nuclearlocalisation）降低極可能是除單倍劑量不足外造成單純散發(fā)VSD的重要原因。從這些方面入手，結(jié)合最新的檢測技術(shù)可能會更加全面地幫助我們認識VSD的致病機理。
【關(guān)鍵詞】：先天性心臟病 室間隔缺損 TBX5基因 基因突變
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R725.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 符號和單位說明11-13
• 前言13
• 研究背景13-16
• 實驗材料及方法16-22
• 實驗結(jié)果22-25
• 討論25-32
• 基于本研究的見解及今后實驗的新方向32-34
• 參考文獻34-40
• 致謝40-42
• 綜述42-51
• 參考文獻47-51
• 在校期間發(fā)表的論文、撰寫的標(biāo)書及獲獎情況51

【共引文獻】

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本文編號：525764