發(fā)布時間：2017-07-01 03:15

  本文關(guān)鍵詞：表沒食子兒茶素沒食子酸酯對乳腺癌細胞MT1-MMP表達及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的： 世界范圍內(nèi),乳腺癌以其逐年升高的發(fā)病率成為女性惡性腫瘤的首位。在我國,乳腺癌的發(fā)病率也逐年增長,并且越來越年輕化。盡管手術(shù)為主的綜合治療取得了一定的進步,但轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是部分乳腺癌患者預(yù)后不佳的主要因素。癌癥轉(zhuǎn)移擴散仍然是癌癥治療的最大障礙。明確轉(zhuǎn)移的分子機制是至關(guān)重要的,從而能有效的研發(fā)并使用新穎的抗轉(zhuǎn)移治療策略應(yīng)用于臨床。 腫瘤細胞遷移被認為是轉(zhuǎn)移級聯(lián)中至關(guān)重要的一步。目前研究表明,降解腫瘤細胞周圍的基質(zhì)是乳腺癌發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的首要條件。參與基質(zhì)降解的酶類主要是基質(zhì)金屬蛋白酶�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases; MMPs)能通過多種方式促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移�；|(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是一族Zn2+依賴性內(nèi)肽酶,可以降解絕大多數(shù)基質(zhì)成分。在腫瘤產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶中,MMP-2起著非常重要的作用,它具有Ⅳ膠原酶的活性,可以降解基底膜使腫瘤細胞發(fā)生浸潤。MMP-2是以原酶形式產(chǎn)生,目前認為其激活必須依賴MMPs重要成員膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(membrane-type1matrix metalloproteinase; MT1-MMP)。在腫瘤中MMPs的表達反映內(nèi)在組織異質(zhì)性,正如不同的腫瘤表達不同的ECM組件、細胞表面受體和相關(guān)的細胞組織。然而,許多基質(zhì)金屬蛋白酶,包括金屬蛋白酶-1、2、3、7-11和MT1-MMP(MMP-14)在許多人類腫瘤過表達。 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)與腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition, EMT)的關(guān)系密切。MMP能夠破壞由基底膜(basement membrane, BM)和細胞間基質(zhì)(jinterstitial matrix)組成的ECM(extracellular matrix)。各種損傷因素導(dǎo)致上皮組織基底膜構(gòu)造的改變,是導(dǎo)致EMT過程的必要條件。MMP具有降解膠原蛋白、層黏連蛋白和纖維黏連蛋白的能力,使得基底膜被降解,進而誘導(dǎo)EMT的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖和遷移能力的改變。在EMT過程中,E-鈣黏蛋白(Ecadherin)具有非常重要的作用。當細胞間有E-鈣黏蛋白連接時可以有效地調(diào)節(jié)細胞的生長,當轉(zhuǎn)化為N-鈣黏蛋白時,細胞生長失去控制,從而產(chǎn)生具有纖維細胞或者內(nèi)皮細胞作用的能力。另外,N-鈣黏蛋白可以促進細胞增殖與存活,E-鈣黏蛋白在乳腺癌中呈表達下調(diào)而N-鈣黏蛋白表達上調(diào)。MMPs是間質(zhì)細胞表型的特有蛋白之一,既可以作為EMT發(fā)生的一個重要標志物,又可以誘發(fā)EMT。鑒于MMPs是誘導(dǎo)EMT過程的一個關(guān)鍵因素,MMIPs抑制劑則被認為可以有效阻斷腫瘤細胞發(fā)生EMT過程。研究MMPs抑制劑應(yīng)用于臨床上應(yīng)對MMPs促進EMT及其引發(fā)的癌癥進展是一個巨大的挑戰(zhàn)：(1)在腫瘤進展過程中的特定時期,識別特定的MMP的靶點作為促進EMT惡性腫瘤的主要驅(qū)動因素；(2)發(fā)展分子治療方法應(yīng)用于研究抑制MMP靶向抗腫瘤藥物。因此,靶向MMPs已成為臨床防治腫瘤的一個新策略,MMPs抑制劑首當其沖地成為一個研究熱點。目前,多達50多種MMPs抑制劑被列入臨床治療腫瘤的候選藥物,但其中大部分的療效并未得到肯定。缺乏特異性則是其主要原因,故靶向MMP-EMT途徑的腫瘤治療仍然面臨著很大的挑戰(zhàn),不僅需要鑒定出涉及腫瘤進展、促進EMT的主要或單一MMP,而且需要開發(fā)出具有高度特異性、選擇性的MMPs抑制劑。 綠茶是世界上大多數(shù)消費飲料之,是從茶樹的葉子中提取的,是一種常綠灌木山茶科家族。其主要成分為茶多酚,其特點是大量兒茶素的存在,包括epigallocatechin-3-gallate (EGCG)、兒茶素(EGC)epicatechin-3-gallate和表兒茶素(EC)。其中,EGCG一直被認為是最強大的防護劑應(yīng)用于癌癥化學(xué)預(yù)防。近年來,越來越多的研究證實茶多酚化合物具有抗腫瘤作用。茶多酚中主要有效成分為表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG),占茶多酚的80%左右。近幾年對EGCG抗癌機制的研究越來越重視：1.誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；2.誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯；3.對細胞信號傳導(dǎo)通路的影響；4.抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲；5.抑制腫瘤增殖和血管生成。研究發(fā)現(xiàn),不論在體外還是體內(nèi),EGCG對許多腫瘤細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移具有抑制作用。在人纖維肉瘤HT-1080細胞中,EGCG能抑制膜類基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)活性從而導(dǎo)致MMP-2在細胞表面積聚。這可能是EGCG抑制腫瘤細胞侵襲的作用機制。目前已有研究提示,EGCG可抑制MMP-2活性從而抑制腫瘤細胞浸潤與轉(zhuǎn)移。關(guān)于EGCG與基質(zhì)金屬蛋白酶家族的關(guān)系鮮有報道,主要集中在EGCG抑制MMP-2活性研究上,而EGCG抑制MMP-2的活性可能主要是因為EGCG抑制MT1-MMP蛋白活性。然而,目前國內(nèi)外針對EGCG抑制MT1-MMP活性的研究的報道較少。因此,本研究擬探討EGCG是否能夠通過抑制MT1-MMP對乳腺癌起抑制作用。 為此,本研究首先驗證涉及腫瘤進展、促進EMT的主要或單一MMPs為MT1-MMP,然后以不同濃度EGCG藥物干預(yù)過表達MT1-MMP蛋白的乳腺癌細胞后,檢測其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖能力及細胞侵襲力的情況,從而探討EGCG抑制乳腺癌MT1-MMP蛋白表達、抑制EMT過程、浸潤和轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機制。 研究方法： 1.檢測MT1-MMP在不同人乳腺癌細胞系中的表達情況。選取6種乳腺癌細胞株(MDA-MB-435s、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF-7、BT549、HS578T),我們采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測各乳腺癌細胞系中MT1-MMP的mRNA表達水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因較正mRNA含量的變異,每份樣品均進行3次重復(fù)獨立實驗。采用擴增倍數(shù)(2-△△Ct)表示MT1-MMP的mRNA相對表達量,擴增倍數(shù)=2-△△Ct。 2.利用pcDNA3.1-MT1-MMP真核表達載體,檢測過表達MT1-MMP對乳腺癌細胞系的影響。我們成功篩選出低表達MT1-MMP的乳腺癌細胞系MCF-7后,將MCF-7乳腺癌細胞分成(1)未轉(zhuǎn)染組；(2)空白質(zhì)粒組；(3)轉(zhuǎn)染組,利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將pcDNA3.1-MT1-MMP轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞株MCF-7。在乳腺癌細胞系MCF-7中過表達MT1-MMP,通過實時熒光定量PCR檢測各組MT1-MMP的mRNA表達水平,蛋白印跡(Western blotting)技術(shù)檢測各組MCF-7細胞內(nèi)MT1-MMP蛋白的表達情況,Western blot檢測EMT相關(guān)標志物蛋白的表達水平,CCK-8實驗檢測了細胞增殖能力是否發(fā)生變化,Transwell實驗觀察了過表達MT1-MMP后細胞侵襲能力是否發(fā)生變化； 3.檢測不同濃度的EGCG處理后對各組乳腺癌細胞系的影響。對各組分別予0、5、10、15umol/LEGCG處理后,通過實時熒光定量PCR檢測MT1-MMP的mRNA表達水平是否發(fā)生改變,Western blot檢測了EMT相關(guān)分子的蛋白表達水平是否變化,CCK-8實驗觀察了細胞增殖能力是否發(fā)生變化,Transwell實驗觀察了過表達MT1-MMP后細胞侵襲能力是否發(fā)生變化； 4.實驗數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。細胞增殖試驗、細胞侵襲實驗均用mean±SD表示。如果方差齊,采用方差分析(One-Way ANOVA)多組間比較,然后采用LSD法進行兩兩比較,如果方差不齊,采用Welch法多組間比較,然后采用Dunnet's T3方法進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05,p0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1) MT1-MMP在不同乳腺癌細胞系中的表達不同,其中在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中表達最高,而在乳腺癌細胞系MCF-7中表達最低。本文以乳腺癌細胞系MCF-7為細胞模型進行研究； 2)命名為pcDNA3.1-MT1-MMP真核表達載體,首先在乳腺癌細胞系MCF-7中過表達MT1-MMP,將MCF-7乳腺癌細胞分成：(1)未轉(zhuǎn)染組(MCF-7)；(2)空白質(zhì)粒組(pcDNA3.1-MCF-7);(3)轉(zhuǎn)染組(pcDNA3.1-MT1-MMP-MCF-7)。實時熒光定量PCR檢測各組MT1-MMP的mRNA的表達情況,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MT1-MMP后,MCF-7的MT1-MMP的mRNA的表達水平上調(diào)；Western blot檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MT1-MMP后,出現(xiàn)MT1-MMP蛋白表達；過表達MT1-MMP后EMT相關(guān)分子E-cadherin蛋白表達水平下調(diào),而N-cadherin蛋白表達水平則上調(diào)；與此同時,CCK-8實驗觀察發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力增強,Transwell實驗觀察發(fā)現(xiàn)細胞侵襲能力增強。這證明過表達MT1-MMP能促進EMT發(fā)生、細胞的增值及侵襲能力增強； 3)對各組分別予0、5、10、15umol/L EGCG藥物處理后,通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),EGCG處理后,MT1-MMP的mRNA表達水平顯著下調(diào),Western blot檢測發(fā)現(xiàn)EGCG處理后MT1-MMP的蛋白表達水平下調(diào),且EMT相關(guān)分子E-cadherin蛋白表達水平上調(diào),而N-cadherin蛋白表達水平則下調(diào)；EGCG處理后,CCK-8實驗檢測發(fā)現(xiàn)各組細胞增殖減緩,Transwell實驗觀察發(fā)現(xiàn)各組細胞侵襲能力減弱,且15umol/L EGCG處理組細胞侵襲及增殖能力最小。這說明EGCG處理后能有效抑制EMT發(fā)生、細胞的增殖及侵襲能力減弱。且具有濃度依賴性。 結(jié)論： 1) MT1-MMP在不同乳腺癌細胞系中表達不同,其中在乳腺癌細胞MDA-MB-231中表達最高,而在乳腺癌細胞系MCF-7中表達最低。 2) MT1-MMP對乳腺癌細胞系MCF-7的影響。過表達MT1-MMP能促進乳腺癌細胞系EMT的發(fā)生及增殖能力和侵襲能力增強； 3) EGCG對乳腺癌細胞EMT的發(fā)生、增殖能力、侵襲力具有抑制作用,其機制可能與抑制MT1-MMP有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：表沒食子兒茶素沒食子酸酯 基質(zhì)金屬蛋白酶 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶 -1 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 乳腺癌
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 前言18-29
• 1.1 MT1-MMP的結(jié)構(gòu)、表達的調(diào)節(jié)機制、激活和抑制作用18-21
• 1.2 EMT與MMPs的關(guān)系和臨床意義21-24
• 1.3 EGCG的抗腫瘤作用24-27
• 1.4 本研究的主要研究內(nèi)容27-29
• 第二章 實驗材料與方法29-43
• 2.1 實驗材料29-31
• 2.2 實驗方法31-43
• 第三章 結(jié)果43-53
• 3.1 實時熒光定量RT-PCR檢測人乳腺癌細胞系中MT1-MMP的表達43-44
• 3.2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MT1-MMP后,過表達MT1-MMP對乳腺癌細胞系MCF-7影響44-47
• 3.3 檢測不同濃度的EGCG處理后對各組乳腺癌MCF-7細胞系的影響47-53
• 第四章 討論53-58
• 第五章 結(jié)論58-59
• 參考文獻59-73
• 碩士論文發(fā)表情況73-74
• 附錄74-76
• 致謝76-78

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 孫正魁;馬行天;唐華;姚榛祥;;乳腺癌干細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物表達變化及意義[J];實用癌癥雜志;2010年02期

2 姚廣裕;曾木圣;林鵬;宋立兵;張星;何潔華;楊名添;戎鐵華;;膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1對乳腺癌細胞浸潤能力的影響[J];中華腫瘤雜志;2006年09期

  本文關(guān)鍵詞：表沒食子兒茶素沒食子酸酯對乳腺癌細胞MT1-MMP表達及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：504443