本文關(guān)鍵詞：念珠菌與新型隱球菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的旨在建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）檢測(cè)體系，以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、特異、定量地檢測(cè)包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌以及新型隱球菌在內(nèi)的臨床侵襲性真菌感染常見(jiàn)的病原菌，為臨床醫(yī)生對(duì)該疾病的診斷、治療提供指導(dǎo)。 方法于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)、中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)購(gòu)買(mǎi)真菌標(biāo)準(zhǔn)株，培養(yǎng)后制成濃度約為107CFU/ml真菌標(biāo)準(zhǔn)株混懸液，10倍梯度稀釋成107~100CFU/ml，用于真菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測(cè)體系的建立。在基因庫(kù)(NCBI)中分別下載多種真菌、細(xì)菌、病毒以及人類基因序列，，通過(guò)比對(duì)找出五種真菌：白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和新型隱球菌各自的特異性區(qū)域，利用Primer Premier5.0和Beacon Designer7.7設(shè)計(jì)引物探針。通過(guò)對(duì)比一步裂解法、Lyticase酶消化法、玻璃珠破壁法、Biospin膜吸附法、磁珠法、濃縮裂解法、濃縮裂解結(jié)合加熱等方法提取真菌DNA的效率及擴(kuò)增效果，尋找真菌DNA提取的最佳方法。同時(shí)通過(guò)對(duì)Mg~(2+)、dNTP、引物及探針濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，篩選出各自的最佳反應(yīng)體系，并驗(yàn)證反應(yīng)體系的特異性、重復(fù)性，并分析各自反應(yīng)的靈敏度，對(duì)臨床分離出的86例真菌病原菌進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果成功設(shè)計(jì)白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和新型隱球菌的特異性引物探針，念珠菌及新型隱球菌的DNA提取效率以及熒光定量PCR效果以濃縮裂解結(jié)合加熱的方法最佳，擴(kuò)增曲線呈典型“S”形。在最佳反應(yīng)體系下，五種真菌的PCR反應(yīng)體系均能分別對(duì)各自對(duì)應(yīng)的真菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而與其他真菌、細(xì)菌、病毒以及人類基因組之間無(wú)交叉反應(yīng)。每一個(gè)反應(yīng)體系不同底物濃度與Ct值之間成良好的線性關(guān)系，R~2均在0.995以上。白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌以及新型隱球菌反應(yīng)體系檢測(cè)的靈敏度為5CFU/ml，熱帶念珠菌靈敏度為50CFU/ml，所有反應(yīng)體系穩(wěn)定性、重復(fù)性好，批內(nèi)、批間重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)，所得每一種反應(yīng)體系Ct值批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均小于5%（在0.22%至3.19%之間）。所建立的5種反應(yīng)體系對(duì)臨床分離菌株檢測(cè)的結(jié)果陽(yáng)性率為100%，并且無(wú)交叉反應(yīng)發(fā)生。 結(jié)論濃縮裂解結(jié)合加熱法是適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的成功、高效的真菌DNA提取方法。成功設(shè)計(jì)了特異性檢測(cè)白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和新型隱球菌的引物探針，并建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系。臨床常見(jiàn)的五種致病真菌病原菌全部檢出，實(shí)驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)體系結(jié)果可靠，擁有廣泛作為臨床侵襲性真菌感染診斷有效手段的巨大潛能。
【關(guān)鍵詞】：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 念珠菌 新型隱球菌
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R725.1;R3416
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 中英文縮略語(yǔ)名詞對(duì)照表11-12
• 前言12-17
• 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 1．實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 2．實(shí)驗(yàn)儀器19
• 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 1．標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)及制備19-20
• 2．核酸提取20-21
• 3．引物探針設(shè)計(jì)21
• 4．PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序21
• 5．PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化21-22
• 6．特異性試驗(yàn)22
• 7．重復(fù)性試驗(yàn)22
• 8．線性范圍測(cè)定試驗(yàn)和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備22
• 9．靈敏度分析試驗(yàn)22
• 10．Hex 內(nèi)標(biāo)分析22-23
• 11．?dāng)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析23
• 12．臨床檢測(cè)23
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-46
• 1．引物探針設(shè)計(jì)23-25
• 2．標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)結(jié)果25-27
• 3．PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果27-28
• 4．DNA 提取方法比較28-31
• 5．特異性試驗(yàn)31-32
• 6．反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果32-34
• 7．重復(fù)性試驗(yàn)34-39
• 8．線性范圍測(cè)定試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立39-42
• 9．靈敏度分析試驗(yàn)42-43
• 10．內(nèi)標(biāo)加入比較結(jié)果43-44
• 11．臨床真菌檢測(cè)結(jié)果44-46
• 討論46-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-63
• 綜述63-76
• 參考文獻(xiàn)71-76
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及參與的課題76-77
• 致謝77

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 宋阿霞;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所干細(xì)胞移植中心侵襲性真菌感染的危險(xiǎn)因素及預(yù)后分析[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：499048