本文關(guān)鍵詞：小兒肝母細(xì)胞瘤血清中非炎癥標(biāo)記物的篩選及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 肝母細(xì)胞瘤在小兒中的發(fā)病率約為0.5～1.5/百萬，在所有小兒肝臟惡性腫瘤中約占50%～79%，是小兒最常見的肝臟惡性腫瘤，發(fā)病年齡多為出生后6月~3歲，男孩多見。其病因目前仍不明確，可能與胚胎時期肝臟細(xì)胞結(jié)締組織分化發(fā)育異常、氧自由基損傷肝細(xì)胞及遺傳因素等因素有關(guān)。肝母細(xì)胞瘤早期多無特殊臨床癥狀，首發(fā)癥狀多是表現(xiàn)為上腹部巨大包塊。肝母細(xì)胞瘤多為單發(fā)性，肝右葉常見。肝母細(xì)胞瘤的病理分型包括胎兒型、胚胎型及混合型。肝母細(xì)胞瘤的影像學(xué)檢查包括B超、CT（包括ECT）及肝動脈造影等。約有1/2～2/3患兒被認(rèn)為是不能Ⅰ期切除，且發(fā)現(xiàn)時多有肺臟等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故未能完整切除瘤體的患兒往往預(yù)后不良。但是，肝母細(xì)胞瘤仍然是可治愈的小兒惡性腫瘤，早期診斷及早期治療可以顯著提高患兒生存率。 近二十年來，蛋白質(zhì)組學(xué)飛速發(fā)展，根據(jù)其研究的目的和方法的差異，蛋白質(zhì)組學(xué)分為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、功能蛋白質(zhì)組學(xué)和表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)中最有價值的優(yōu)點在于在實驗中可以觀察到完整的蛋白質(zhì)在生理及病理狀態(tài)下的變化。其主要相關(guān)技術(shù)包括雙向凝膠電泳、差異凝膠電泳、質(zhì)譜分析等，近年來蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)和生物信息學(xué)分析也應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)，通過上述技術(shù)可對蛋白質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析確定。蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤中的應(yīng)用主要有①發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物；②鑒定腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)作為早期臨床診斷的工具；③探索疾病的發(fā)病機制和治療途徑。生物磁珠可將血清中所含的復(fù)雜樣品中的蛋白質(zhì)富集并純化，這利用的是離子磁珠的特殊吸附功能。不同類型、不同功能的磁珠可吸附不同的肽段或蛋白質(zhì),磁珠捕獲后的蛋白也亦洗脫下來進(jìn)行濃縮，從而增加了目標(biāo)蛋白的數(shù)量，提高在凝膠電泳中的敏感度，使蛋白組學(xué)技術(shù)更趨穩(wěn)定。目前，磁珠已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)中，從而對于差異性峰值的鑒定大有裨益。表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，為進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)提供了新的途徑�；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MELDI-TOF-MS）的推廣可對樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行全景檢測和分析，從而顯示各種差異性蛋白的分子量及相對豐度，從而監(jiān)測疾病早期蛋白質(zhì)的變化。由此可見，蛋白質(zhì)組學(xué)從微觀水平研究蛋白的屬性，使人們對細(xì)胞變化、疾病的演變有一宏觀的認(rèn)識。對于腫瘤，其發(fā)病過程中某些蛋白質(zhì)的表達(dá)或變化，也清晰的呈現(xiàn)在我們面前。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥因子與其密切相關(guān)，國際上權(quán)威的《Cancer》、《Cell》等雜志也都提到了炎癥與癌癥密切關(guān)聯(lián)。其原因可能是miRNA的存在，而每個miRNA可以調(diào)控若干蛋白。因此，實驗中，排除相關(guān)炎癥因子的干擾顯得猶為重要。本研究主要應(yīng)用雙向電泳（2-DE）和質(zhì)譜技術(shù)（MS）對肝母細(xì)胞瘤患兒術(shù)前血清、炎癥患兒（SIRS）血清及正常小兒血清進(jìn)行檢測，篩選出相對特異的非炎癥蛋白質(zhì)標(biāo)記物，并進(jìn)行鑒定，構(gòu)建更為完善的肝母細(xì)胞瘤早期診斷血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，為進(jìn)一步研究小兒肝母細(xì)胞瘤的血清中特異性蛋白奠定基礎(chǔ)。通過對腫瘤樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測，并繪制蛋白質(zhì)指紋圖譜，與相應(yīng)對照組蛋白指紋圖譜比較，可找到多種差異蛋白質(zhì)，并優(yōu)化成為標(biāo)志物組合模型，多種腫瘤標(biāo)志物的組合可提高診斷的特異性和敏感度。蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)為篩選具有特異性和敏感性的標(biāo)志物提供了新的研究思路和方法。 目的 通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在排除炎癥因素干擾下，檢測小兒肝母細(xì)胞瘤血清中相對特異的蛋白質(zhì)，構(gòu)建更加完善和齊備的肝母細(xì)胞瘤早期診斷的蛋白質(zhì)圖譜框架，為進(jìn)一步研究小兒肝母細(xì)胞瘤的血清中特異性的蛋白奠定基礎(chǔ)。材料與方法 材料 收集我院自2011年12月至2013年10月小兒肝母細(xì)胞瘤患兒術(shù)前血清30例，其中男19例，女11例，年齡2月～5歲，平均1.9+0.2歲，且術(shù)后病理證實為肝母細(xì)胞瘤；全身炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS）患兒20例，男12例，女8例，年齡6月～10歲，平均3.5+0.1歲。收集正常兒童血清20例，其中男10例，女10例，年齡6月～9歲，平均3.8+0.2歲。均在清晨05:00～06:00空腹?fàn)顟B(tài)使用干燥管抽取血標(biāo)本，于室溫下靜置1h后，使用3000r/min離心機離心20min，，取上清液，標(biāo)記后迅速于-80℃冰箱保存。 方法 1.血清通過弱陽離子磁珠（MB-WCX)處理 將肝母細(xì)胞瘤患兒血清、SIRS患兒血清和對照組血清于冰水浴中解凍，4℃離心10000r/min離心5min，取5ul上清，應(yīng)用弱陽離子（MB-WCX）磁珠芯片對其進(jìn)行上樣。 2.采用SELDI-TOF-MS質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行血清差異蛋白篩選 設(shè)置質(zhì)譜儀的參數(shù)、最佳激光強度和最佳靈敏度，將結(jié)合好的蛋白質(zhì)芯片裝入質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測，并詳細(xì)記錄。在SELDI-TOF-MAS平臺上，對血清差異蛋白進(jìn)行篩選。通過軟件進(jìn)行分析，得到樣本中各個蛋白的m/z峰值，選擇其中差異小于0.3%的考慮為一類。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗，分析腫瘤組與正常組、正常組與炎癥組之間的數(shù)值，從中得到兩組差異性m/z峰值，選擇范圍+0.3%，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)腫瘤血清中特異性的蛋白峰值，并與炎癥血清中鋒值對比，排除是否與炎癥因子相關(guān)。 3.采用電泳方法對蛋白進(jìn)行分離 制備膠體后，取離心后血清5ml，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，參考Protein Ladder，切取對應(yīng)軸上的膠片，并進(jìn)行標(biāo)記。 4.膠內(nèi)酶解 參考膠內(nèi)酶解說明書，對切取的膠片進(jìn)行酶解，加入提取液后，離心提取上清液。 5.采用MALDI-TOF-MS確定目標(biāo)蛋白 采用Nano HPLC于蛋白芯片上打板后，用MALDI-TOF/TOF進(jìn)行鑒定。收集相應(yīng)的肽段后，在SwissProt數(shù)據(jù)庫中查找相應(yīng)的目標(biāo)蛋白。 結(jié)果 1.小兒肝母細(xì)胞瘤術(shù)前組與正常組的比較結(jié)果 小兒肝母細(xì)胞瘤術(shù)前組和正常組質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過分析得到各自的峰值，采用Wilcoxon秩和檢驗對兩組峰值進(jìn)行分析，從而得到10個特異性m/z峰值（P0.01）。分析得出：小兒肝母細(xì)胞瘤高表達(dá)的有4個，小兒肝母細(xì)胞瘤低表達(dá)的有6個。經(jīng)過SVM篩選出youden指數(shù)最高的組合模型，得到m/z峰位于9348蛋白標(biāo)記物一個。該標(biāo)記物在小兒肝母細(xì)胞瘤血清術(shù)前組中低表達(dá)，表達(dá)強度分別為29.0+20.9（m/z9348）。在正常兒童組高表達(dá)，表達(dá)強度為2036.7+881.5（m/z9348）。兩組比較差值具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。 2. SIRS患兒組與正常組的比較結(jié)果 SIRS患兒組與對照組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過處理和統(tǒng)計學(xué)分析后，得到特異性m/z峰10個（P0.01）。分析得出：其中SIRS組中高表達(dá)為6個，SIRS組中低表達(dá)的有4個。參考youden指數(shù)最高的組合模型，得到m/z峰位于5833的蛋白質(zhì)標(biāo)記物一個。在炎癥患兒中高表達(dá)，表達(dá)強度為1283.0+943.3（m/z5833）。在正常兒童組中低表達(dá)，表達(dá)強度為75.7+75.1（m/z5833）。兩組比較差值具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。 3.小兒肝母細(xì)胞瘤血清中與炎癥相關(guān)的特異性峰值結(jié)果 利用SELDI-TOF-MAS平臺分別在小兒肝母細(xì)胞瘤組與正常組、炎癥組與正常組得到特異性峰值，通過兩組結(jié)果的比較，兩組間有差異性蛋白質(zhì)峰值，其中m/z峰位于9348蛋白標(biāo)記物在炎癥組中未找到相似值（參考范圍為+0.3%）。結(jié)果表明m/z峰位于9348蛋白標(biāo)記物為非炎癥標(biāo)記物。 4.特異性蛋白的鑒定 分離、純化、酶解血清標(biāo)本中的目標(biāo)蛋白，利用MALDI-TOF-TOF平臺對得到的肽段進(jìn)行檢測。經(jīng)檢索得到，m/z峰位于9348的蛋白質(zhì)經(jīng)過鑒定為ApoAI，m/z峰位于5833的蛋白質(zhì)經(jīng)過鑒定為CCL7。 結(jié)論 1、m/z峰為9348的蛋白質(zhì)經(jīng)過鑒定為ApoAI，考慮為肝母細(xì)胞瘤中非炎性標(biāo)記物，可為肝母細(xì)胞瘤構(gòu)建更為完善的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。 2、前期實驗表明載脂蛋白存在于其它腫瘤中，此次實驗表明肝母細(xì)胞瘤中ApoAI低表達(dá)，對進(jìn)一步研究ApoAI具有參考意義。
【關(guān)鍵詞】：小兒肝母細(xì)胞瘤 蛋白質(zhì)組學(xué) 標(biāo)記物 載脂蛋白AI
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-9
• Abstract9-16
• 中英文縮略詞16-17
• 前言17-20
• 材料與方法20-24
• 結(jié)果24-28
• 討論28-35
• 結(jié)論35-36
• 附圖36-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 綜述40-52
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 個人簡歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文52-53
• 致謝53

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;ApoB/apoA1 is an effective predictor of coronary heart disease risk in overweight and obesity[J];Journal of Biomedical Research;2011年04期

  本文關(guān)鍵詞：小兒肝母細(xì)胞瘤血清中非炎癥標(biāo)記物的篩選及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：481471