本文關(guān)鍵詞：表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)雞胱抑素I66Q突變體聚集的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：常見(jiàn)的淀粉樣疾病包括老年癡呆癥(阿爾茲海默氏癥)、帕金森氏癥、Ⅱ型糖尿病,它們都與一些致病蛋白質(zhì)發(fā)生淀粉樣纖維化沉積有關(guān)。目前針對(duì)于這一類(lèi)疾病的早期檢測(cè)仍有很大困難,且在臨床治療上尚無(wú)特效藥物,因此距離根治此類(lèi)疾病仍有很遠(yuǎn)的距離。近年來(lái)針對(duì)于通過(guò)抑制淀粉樣蛋白纖維化來(lái)延緩和治療淀粉樣纖維疾病的研究積累了一定的成果,很多具有抑制淀粉樣纖維能力的天然小分子成為了研究熱點(diǎn),其中茶多酚作為從我國(guó)國(guó)飲中提取的天然產(chǎn)物更是備受關(guān)注。茶中富含的多酚類(lèi)成分具有顯著地抗氧化、抗菌、抗病毒等生物學(xué)活性。其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)在茶葉中含量較高。大量研究證實(shí)茶多酚作為綠茶中含量最多的多酚類(lèi)化合物,能夠與解折疊的多肽結(jié)合并阻止其向淀粉樣纖維轉(zhuǎn)變。然而,與Aβ及其他的淀粉樣纖維蛋白不同,遺傳性胱抑素C腦淀粉樣血管病(HCCAA)的致病蛋白人胱抑素L68Q突變體(h CC)是通過(guò)結(jié)構(gòu)域交換的方式形成二聚體進(jìn)而形成纖維的淀粉樣蛋白。為了探究EGCG的這種抗纖維化特性是否只是針對(duì)幾種特定的致病蛋白還是可以作為一種更廣譜的淀粉樣纖維抑制劑,我們將其對(duì)于雞胱抑素I66Q突變體的纖維化是否有抑制效果進(jìn)行研究。雞胱抑素I66Q突變體與人胱抑素的構(gòu)象非常相似,而且雞胱抑素比人胱抑素更加穩(wěn)定,因此我們將雞胱抑素作為體外研究淀粉樣纖維形成實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本研究通過(guò)Th T熒光檢測(cè)和透射電子顯微鏡檢測(cè)了EGCG針對(duì)經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)體系分泌并精制純化的雞胱抑素I66Q突變體體外成纖維的抑制效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的且濃度依賴(lài)性的抑制能力,使雞胱抑素I66Q突變體形成了結(jié)構(gòu)松散無(wú)定型、無(wú)毒性的聚集體。為了初步探究EGCG的抑制機(jī)制,我們運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬軟件從分子水平研究了小分子與蛋白質(zhì)的相互作用,分子對(duì)接模擬結(jié)果說(shuō)明EGCG分子很可能楔入雞胱抑素I66Q突變體的α螺旋結(jié)構(gòu)域、β折疊結(jié)構(gòu)域及AS區(qū)域之間形成的溝槽中,從而在空間上使AS結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,阻止蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)域交換,繼而使其在極端的蛋白變性條件下,穩(wěn)定在原始狀態(tài)而避免其向無(wú)定型聚集物轉(zhuǎn)變。通過(guò)分子對(duì)接模擬提出的推測(cè)也符合ANS熒光檢測(cè)雞胱抑素I66Q突變體成纖維過(guò)程總疏水核心變化的結(jié)果。本研究首次發(fā)現(xiàn)了EGCG對(duì)通過(guò)結(jié)構(gòu)域交換方式的淀粉樣蛋白的纖維化具有抑制能力,并在分子水平上初步闡明其抑制機(jī)制,我們的研究一方面表明由于EGCG作為綠茶中含量很多的有效成分,可為系統(tǒng)研究含有EGCG的藥用制劑,擴(kuò)大其臨床應(yīng)用的適應(yīng)癥奠定研究基礎(chǔ),更深層次的受益是,調(diào)整我們?nèi)粘５娘嬍沉?xí)慣對(duì)于預(yù)防淀粉樣疾病及增強(qiáng)老年人的身體健康將起到重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：淀粉樣纖維化 雞胱抑素I66Q突變體 EGCG 分子對(duì)接模擬
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R597.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-21
• 0.1 淀粉樣疾病12
• 0.2 胱抑素C（Cystatin C）與人胱抑素（human Cystatin C，，HCC）12-13
• 0.3 雞胱抑素C（chicken Cystatin C）13-14
• 0.4 淀粉樣纖維（amyloid fibre）14-15
• 0.5 抗纖維化小分子對(duì)淀粉樣蛋白疾病治療的研究15-16
• 0.6 茶多酚16-17
• 0.7 淀粉樣蛋白纖維檢測(cè)及分析方法17-19
• 0.7.1 ThT（硫磺素T）熒光檢測(cè)17-18
• 0.7.2 ANS（8-苯胺1萘磺酸）熒光檢測(cè)18
• 0.7.3 透射電子顯微鏡檢測(cè)（TEM）18
• 0.7.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)（MTT法）18-19
• 0.8 分子動(dòng)力學(xué)模擬（Molecular Dynamic Simulations）19
• 0.9 分子對(duì)接模擬（Docking studies）19-21
• 第一章 雞胱抑素I66Q突變體的表達(dá)、純化及淀粉樣纖維的培養(yǎng)21-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 1.1.1 菌株21
• 1.1.2 主要試劑21-22
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備22-23
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法23-26
• 1.2.1 培養(yǎng)基與化學(xué)試劑的配制23-24
• 1.2.2 胞外雞胱抑素突變體I66Q的表達(dá)及純化24-25
• 1.2.3 雞胱抑素I66Q突變體的淀粉樣纖維培養(yǎng)25-26
• 1.2.4 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理26
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論26-28
• 1.3.1 利用畢赤酵母表達(dá)雞胱抑素I66Q突變體及其純化26-27
• 1.3.2 雞胱抑素I66Q突變體淀粉樣纖維的培養(yǎng)27-28
• 1.4 本章小結(jié)28-29
• 第二章 EGCG對(duì)雞胱抑素I66Q突變體淀粉樣纖維形成的影響29-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料29-30
• 2.1.1 主要試劑29
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備29-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-32
• 2.2.1 主要化學(xué)試劑的配制30
• 2.2.2 ANS熒光檢測(cè)30-31
• 2.2.3 透射電子顯微鏡檢測(cè)31
• 2.2.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)31-32
• 2.2.5 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論32-37
• 2.3.1 利用ThT熒光檢測(cè)EGCG對(duì)雞胱抑素I66Q突變體淀粉樣纖維形成的影響32-33
• 2.3.2 利用ANS熒光檢測(cè)EGCG對(duì)雞胱抑素I66Q突變體淀粉樣纖維形成的影響33-34
• 2.3.3 利用透射電子顯微鏡（TEM）檢測(cè)EGCG對(duì)雞胱抑素I66Q突變體淀粉樣纖維形成的影響34-36
• 2.3.4 利用MTT法檢測(cè)雞胱抑素I66Q突變體淀粉樣纖維及寡聚體的細(xì)胞毒性36-37
• 2.4 本章小結(jié)37-38
• 第三章 應(yīng)用AutoDock分子對(duì)接軟件研究EGCG與雞胱抑素I66Q突變體分子間的相互作用38-48
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 3.1.1 所需實(shí)驗(yàn)軟件及功能38
• 3.1.2 蛋白及小分子EGCG結(jié)構(gòu)文件38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 3.2.1 利用GROMACS 4.5.0 軟件對(duì)雞胱抑素I66Q突變體進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬38-39
• 3.2.2 應(yīng)用AutoDock分子對(duì)接軟件研究EGCG與雞胱抑素I66Q突變體分子間的相互作用39-40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論40-46
• 3.3.1 雞胱抑素I66Q突變體蛋白在成纖維模擬條件下的結(jié)構(gòu)變化40-41
• 3.3.2 AutoDock對(duì)接結(jié)果能量分析及不同表位的分布41-42
• 3.3.3 最優(yōu)結(jié)合表位分析42-44
• 3.3.4 第二可能結(jié)合表位分析44-46
• 3.4 本章小結(jié)46-48
• 結(jié)論與展望48-50
• 致謝50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況55-56

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本文編號(hào)：393986