目的:人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）是人類皰疹病毒組中最大的雙鏈DNA病毒,感染較廣泛,但是通常在健康群體中不發(fā)病,呈亞臨床狀態(tài)。然而,對于免疫低下或缺陷的群體,比如孕婦、兒童、移植受體或艾滋病患者,它會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥,甚至死亡。HCMV至今仍被認(rèn)為是導(dǎo)致新生兒先天及圍產(chǎn)期感染最重要的病毒之一,兒童尤其是6個月以下的嬰兒和早產(chǎn)兒,由于其免疫力較低,極易罹患HCMV的感染,主要表現(xiàn)為不同程度的多器官組織的損傷尤其是對肝功能的損傷,此外神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸、血液及泌尿等系統(tǒng)都會出現(xiàn)不同程度的感染和損傷。HCMV感染機(jī)體后所誘導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制及致病機(jī)制十分復(fù)雜。而具有重要的基因調(diào)節(jié)作用的microRNA（miRNA）在HCMV感染過程中發(fā)揮了重要作用,在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用,通過完全或不完全結(jié)合介導(dǎo)靶分子mRNA的降解或抑制其翻譯,進(jìn)一步調(diào)控基因的表達(dá)。細(xì)胞或病毒編碼的miRNAs可以選擇性地包裝入外泌體等囊泡,廣泛存在于人的多種體液,包括尿液、唾液、血液、乳汁、羊水、腦脊液等,并且不被相關(guān)核酸酶所降解,從而在機(jī)體局部或全身循環(huán)發(fā)揮細(xì)胞間信息... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

外泌體的鑒定A：透射電鏡下觀察到的經(jīng)HCMV感染HELF細(xì)胞的外泌體；BC：Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文12劑盒說明書中介紹該試劑盒采用的是膜吸附法分離純化細(xì)胞外泌體，由于HCMV病毒具有脂質(zhì)病毒包膜，且病毒顆粒大小與外泌體相近，為了避免由于外泌體樣本中混有病毒顆粒，影響接下來外泌體核酸深度測序結(jié)果的真實(shí)性，我們對外泌體樣本中是否混有HCMV病毒顆粒進(jìn)行了檢測鑒定。由于我們選擇的HCMV的HanBAC株具有綠色熒光蛋白（greenfluorescenceprotein,GFP）標(biāo)記蛋白，因此被感染HanBAC的細(xì)胞會在48小時后通過倒置熒光顯微鏡觀察到綠色熒光，通�？勺鳛槌Ｒ�(guī)檢測感染效率的一種手段。我們將分離純化的HanBAC株感染細(xì)胞外泌體加入正常HELF細(xì)胞培養(yǎng)液中，在48、72及96小時分別通過倒置熒光顯微鏡觀察是否有GFP熒光信號，鑒定經(jīng)試劑盒分離純化的外泌體是否混有HCMV病毒顆粒。結(jié)果顯示（見圖1.2），與HanBAC感染細(xì)胞陽性對照比較，經(jīng)外泌體處理的HELF細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，在綠色熒光激發(fā)條件下始終未見GFP熒光信號。由此提示，實(shí)驗(yàn)中分離純化的HCMV感染細(xì)胞外泌體樣本中沒有HCMV病毒顆粒的污染。圖3.2熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)HELF細(xì)胞48h、72h和96h沒有GFP的表達(dá)；HELF細(xì)胞和HanBAC感染后提取的外泌體共培養(yǎng)48h、72h和96h均沒有GFP的表達(dá)；HELF細(xì)胞被HanBAC株感染后在48h有GFP的表達(dá)，并且在72h和96h逐漸增多。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文14AB圖1.3Agilent2100測序文庫大小A和B兩個文庫長度均為140-150bp皆符合上機(jī)測序要求。3.4測序結(jié)果分析3.4.1小RNA文庫的數(shù)據(jù)分析采用IIIumina公司的Hiseq2500測序技術(shù)對結(jié)果3.3中HanBAC感染/非感染HELF細(xì)胞外泌體小RNA文庫進(jìn)行測序，去除接頭序列以及低質(zhì)量序列，包括模糊堿基N，堿基質(zhì)量小于10以及長度小于18nt的序列后，各獲得干凈序列的總read數(shù)分別為33,074,443和27,976,426，分別獲得18-32nt長度特異性序列384,735種和


本文編號：3494306