手足口病是一種病毒性傳染病,由腸道病毒引起的,主要的病原體是腸病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A16型（Cox A16）。嬰幼兒及學(xué)齡前兒童易感。少部分的手足口病例可并發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,包括腦膜炎、病毒性腦炎、肢體麻痹等,甚至導(dǎo)致死亡。所以該病的早期診斷顯得非常重要。本研究擬建立手足口病的病毒核酸和血清抗體檢測方法,并對其進(jìn)行初步的臨床評價。目的：建立一種能同時檢測腸道病毒、腸道病毒71型和柯薩奇病毒16型等手足口病病原體核酸的實(shí)時熒光PCR方法；在原核表達(dá)系統(tǒng)中對腸道病毒71型基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化,建立血清中IgM抗體的檢測方法；并進(jìn)一步評估人腸道病毒71型IgM抗體在手足口病早期診斷中的價值。主要方法：1、根據(jù)腸道病毒、腸道病毒71型和柯薩奇病毒16型等手足口病病原體核酸的基因序列,設(shè)計、合成引物和探針,對38例手足口病患者在實(shí)時熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增、檢測和結(jié)果分析,并與常規(guī)RT-PCR方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比對。2、采用RT-PCR的方法,分離EV71 VPl基因；將該片段插入表達(dá)載體pRSET-A,在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),利用純化后的表達(dá)產(chǎn)物,建立檢測EV71 IgM抗體... 

【文章來源】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

部分檢測樣品的熒光探針一法擴(kuò)一增曲線

可判定樣品為人腸道病毒尼V71/CoxA16病毒陽性。一于石不不不烹不蕊李牛事棄棄=井不不芬共二不二不不圖1部分檢測樣品的熒光探針一法擴(kuò)一增曲線結(jié)果品的RT-PCR檢測結(jié)果，EV-com、EV71和CoxA16為116bp、226bp、ZO8bp，如圖2。

所擴(kuò)增的EV7IVPI基因與Genbank公布的NM005672，人EV71VPI基因序列同源率為100%。2.4Ev71VPI原核核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒，進(jìn)行BamHl和Hindlll雙酶切，質(zhì)粒酶切鑒定電泳結(jié)果見圖4。酶切片段大小與預(yù)期一致。3O

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]實(shí)時熒光PCR技術(shù)在手足口病檢測中應(yīng)用[J]. 廖國東,吳文鋒,許桂鋒,許銘清,陳家圖,謝建忠,羅光毅.  中華實(shí)用診斷與治療雜志. 2010(11)
[2]實(shí)時熒光定量PCR快速檢測腸道病毒EV71[J]. 張潤書.  中國醫(yī)學(xué)工程. 2010(03)
[3]檢測EV71和EV-U的TaqMan-LNA探針多重?zé)晒釸T-PCR的建立[J]. 茅凌翔,徐嵐,葛琴娟,鮑務(wù)新,楊靜,吳斌,陳建國,徐順高,黃新祥,許化溪.  臨床檢驗(yàn)雜志. 2010(05)
[4]擬桿菌屬實(shí)時熒光定量PCR的建立[J]. 張薇薇,楊晶艷,王嵬,黃瑋,楊蕊嘉,裴曉方.  現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué). 2010(17)
[5]EV71疫苗的研究進(jìn)展[J]. 李明,尹怡,李晉濤.  生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志. 2010(04)
[6]手足口病預(yù)防控制指南（2009版）[J].   全科醫(yī)學(xué)臨床與教育. 2010(02)
[7]人免疫球蛋白中腸道病毒71型中和抗體效價的測定[J]. 毛群穎,郝春生,張霞,高強(qiáng),何鵬,梁爭論,李鳳祥,王軍志.  微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展. 2010(01)
[8]含腸道病毒71型VP1基因片段RNA病毒樣顆粒的構(gòu)建[J]. 張文帥,崔侖標(biāo),葛以躍,戚宇華,單軍,李顯,史智揚(yáng).  現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué). 2010(03)
[9]EV71抗原ELISA定量檢測方法的建立[J]. 賈卉,蔡芳,高強(qiáng),張建三,井申榮.  中國生物制品學(xué)雜志. 2010(01)
[10]實(shí)時熒光PCR快速檢測鼠疫耶爾森菌方法的建立[J]. 陳金超,高敏,魯立,王麗,徐立風(fēng),劉滌瑕,董鳳珍,唐德羽.  現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志. 2010(02)



本文編號：3435564