本文關(guān)鍵詞：EV71感染相關(guān)miRNA篩選及FNC抗EV71活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：手足口病被列為我國法定丙類傳染病,其發(fā)病率和死亡率在丙類傳染病中居首,已成為嚴重危害嬰幼兒健康和公共衛(wèi)生安全的重要傳染病。感染手足口病的病原體有:腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)、柯薩奇病毒A組(Coxasckievirus A group,CVA)和柯薩奇病毒B組(Coxasckievirus B group,CVB),以EV71和CVA16最為常見。EV71除了引起手、足、口和粘膜部位出現(xiàn)皰疹以及發(fā)熱外,還會出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、心肌炎、急性弛緩性麻痹等疾病[1],特別是一些重癥患兒發(fā)展比較迅速易出現(xiàn)死亡。該病毒主要感染嬰幼兒,尤其是6歲以下的兒童。目前臨床上尚無特效的抗EV71藥物,只能是對癥療法。EV71動物感染模型的缺乏嚴重阻礙了腸道病毒71型治療藥物及抗病毒靶標研究。目的獲得EV71乳鼠適應(yīng)株,建立EV71感染乳鼠模型,為抗EV71藥物的篩選和活性評價提供穩(wěn)定可靠的動物模型;研究EV71感染相關(guān)宿主miRNA,為EV71感染防治提供潛在新型抗病毒藥物靶標,并為研究宿主抗EV71防御機制提供更為深層次的理解;研究核苷類小分子藥物FNC對EV71復(fù)制的抑制作用,并初步探討其抗病毒作用機制,為EV71病毒感染的預(yù)防和治療提供先導(dǎo)化合物或候選藥物。方法1)EV71(BrCr)株病毒通過在1日齡ICR乳鼠上連續(xù)傳代8次,建立EV71(BrCr)株動物適應(yīng)株模型;通過對各適應(yīng)株病毒RNA拷貝數(shù)的測定和乳鼠感染各病毒適應(yīng)株后死亡率計算觀察各適應(yīng)株的毒力增減情況;通過對適應(yīng)株病毒的全基因測序比對突變位點;通過在Vero細胞上大量擴增EV71(H)株病毒,用腹腔注射的方法感染12日ICR乳鼠建立EV71(H)株動物模型。2)應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選預(yù)測EV71感染相關(guān)宿主miRNA,應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測預(yù)測出來的宿主miRNA在EV71感染前后的表達變化,合成制備相應(yīng)宿主miRNA inhibitor,轉(zhuǎn)染細胞后感染病毒,通過CPE法、空斑法、熒光定量PCR法、免疫熒光和免疫印跡的方法測定相應(yīng)miRNA抑制劑對EV71病毒的抑制作用。3)CCK8法篩選出具有抗EV71病毒活性的藥物;通過CCK8法測定FNC在Vero細胞和RD細胞上的細胞毒性和對EV71感染致細胞病變的抑制作用,通過免疫熒光法、空斑形成法及免疫印跡法檢測FNC對EV71感染細胞后上清液中病毒滴度的影響和細胞中VP1蛋白表達的影響;進一步機制研究,檢測FNC對EV71病毒的直接滅活作用、EV71病毒生活周期的影響及3C蛋白酶活性的影響;病毒在RD細胞上連續(xù)傳代14次同時給予FNC抑制病毒,檢測EV71對FNC的耐藥性。結(jié)果1)成功建立了EV71(BrCr)株動物模型,且隨著適應(yīng)代數(shù)的增加毒力有所加強,感染P8-1J-V病毒后能使7日齡ICR和BALB/c乳鼠死亡率達到100%;通過對P8-1J-V全基因測序發(fā)現(xiàn)有4個位點發(fā)生了突變(1819:C→T;2428:C→G;2731:A→G;5259:G→A);成功建立EV71(H)株動物模型,且不論是病毒原液還是病毒5倍稀釋液感染12日齡ICR乳鼠后死亡率均達到70%以上。2)經(jīng)生物信息學(xué)方法預(yù)測,hsa-miR-146a-5p、hsa-mi R-155-5p、hsa-miR-210可能與EV71復(fù)制相關(guān)。熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn),隨著感染時間的增加感染EV71病毒后hsa-mi R-146a、hsa-miR-155、hsa-miR-210的表達量逐漸增加。轉(zhuǎn)染相應(yīng)的miRNA抑制劑能抑制EV71病毒導(dǎo)致的細胞病變,減少培養(yǎng)液中EV71病毒的病毒滴度和病毒RNA的拷貝數(shù),減少EV71病毒VP1蛋白的表達。3)篩藥實驗發(fā)現(xiàn)FNC具有抗EV71病毒活性;FNC抑制EV71致細胞病變,病毒梯度稀釋(MOI分別為10、1和0.1)后感染RD和Vero細胞,其IC50值分別為(88.40±17.99)、(66.07±5.27)、(33.76±4.65)nM;(10.16±2.46)、(12.08±2.07)、(6.40±2.317)nM;FNC能顯著降低病毒感染后上清中病毒滴度和細胞中VP1蛋白的表達。機制研究發(fā)現(xiàn),FNC無直接殺病毒作用;FNC對病毒生活周期的復(fù)制階段作用較明顯(P0.05);0.33g/mL的FNC對3C蛋白酶的活性有微弱的抑制作用。耐藥性實驗發(fā)現(xiàn),200、100nM的FNC連續(xù)14次抑制病毒后對EV71致細胞病變作用未見明顯變化。結(jié)論初步建立了EV71(BrCr)株和EV71(H)株手足口病乳鼠動物模型;hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-210表達與EV71病毒感染相關(guān),抑制hsa-miR-146a、hsa-mi R-155、hsa-miR-210的表達具有抑制EV71病毒復(fù)制的作用,hsa-miR-146a、hsa-miR-155、hsa-miR-210可能發(fā)展成為新型抗EV71病毒藥物靶標;FNC具有抗EV71病毒活性,其作用機制可能是通過抑制病毒的復(fù)制達到抗病毒作用
【關(guān)鍵詞】：腸道病毒71型 動物模型 miRNA FNC 機制
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACTS10-13
• 前言13-16
• 第一部分 腸道病毒71型（EV71）感染乳鼠模型的建立16-29
• 材料與方法16-23
• 1 實驗材料16-17
• 2 實驗方法17-23
• 結(jié)果23-29
• 1 EV71(BrCr)株感染乳鼠模型的建立23-27
• 2 EV71(H) 株感染乳鼠模型的建立27-28
• 3 P8-1J-V病毒適應(yīng)株的序列測定28-29
• 第二部分 抗EV71藥物靶標的篩選和驗證29-41
• 材料與方法29-36
• 1 實驗材料29-30
• 2 實驗方法30-36
• 結(jié)果36-41
• 1 靶向EV71感染宿主miRNA的預(yù)測36
• 2 RD細胞感染EV71病毒后miRNA的表達變化檢測36-38
• 3 miRNA抑制劑對EV71感染RD細胞的影響38-41
• 第三部分FNC抗腸道病毒71活性及作用機制研究41-61
• 材料與方法41-48
• 1 實驗材料41-42
• 2 實驗方法42-48
• 結(jié)果48-61
• 1 FNC抗病毒活性研究48-53
• 2 FNC抗病毒機制研究53-59
• 3 耐藥性實驗59-61
• 討論61-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-70
• 致謝70-71
• 附錄一 附表71-73
• 附錄二 文獻綜述73-80
• 參考文獻77-80
• 附錄三 在校期間論文論著情況和科研情況80

【二級參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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3 秦咸蘊;林霖;楊燕;張書香;孔建強;程克棣;趙云峰;王偉;;EV71非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及其為靶點的藥物研究進展[J];藥學(xué)學(xué)報;2011年07期

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7 陳永宏;徐輝;桂金貴;;注射用雙黃連治療小兒手足口病臨床觀察[J];中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志;2006年01期

  本文關(guān)鍵詞：EV71感染相關(guān)miRNA篩選及FNC抗EV71活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：335605