肺炎鏈球菌氨肽酶N對過敏性哮喘的作用及機制研究
發(fā)布時間：2021-07-20 13:08
目的:流行病學和實驗研究表明,嬰幼兒期接觸微生物可降低患過敏性哮喘的風險。因而使用具有免疫調節(jié)作用的微生物或微生物成分可能成為預防過敏性哮喘的一種新型策略。最近的研究表明肺炎鏈球菌氨肽酶N（PepN）可以抑制T細胞效應功能。因此,本實驗的目的是研究PepN對小鼠過敏性哮喘的作用并初步闡明其作用機制。方法:利用大腸桿菌原核表達技術制備重組蛋白PepN,通過鎳柱純化后進一步去除內毒素。在雞卵清蛋白（OVA）致敏期間通過滴鼻處理小鼠PepN以研究PepN對過敏性哮喘的影響。通過流式細胞術、趨化因子檢測和過繼轉移評估CD11b+樹突狀細胞（CD11b+DCs）在PepN處理的過敏性哮喘小鼠中的作用。此外,使用流式細胞術檢測小鼠肺組織2型固有淋巴細胞（ILC2s）的數(shù)量。最后,在OVA致敏前處理PepN以進一步確定PepN對小鼠過敏性哮喘的影響。結果:成功制備重組蛋白PepN,經純化后其純度高于90%,且其內毒素含量低于0.1EU/μg。在OVA致敏期間處理PepN可以減輕過敏性哮喘小鼠的2型氣道炎癥（嗜酸性粒細胞增多癥、粘液高分泌、Th2細胞因子增加...
【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市
【文章頁數(shù)】：46 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
重組蛋白PepN的制備Figure1PreparationofrecombinantproteinPepN
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文18圖2致敏期間PepN處理對OVA誘導的過敏性哮喘2型氣道炎癥的影響Figure2EffcetofadministrationofPepNduringsensitizationontype2airwayinflammationofOVA-inducedallergicasthmaA,Experimentalprotocol.B,TotalinflammatorycellsandeosinophilsinBALF.C,Th2cytokine(IL-5,andIL-13)levelsinBALF.D,PhotomicrographsofH&E-andPAS-stainedlungtissuesectionsofmice(400Xmagnification)andsemi-quantifiedPASscore.E,Muc5acmRNAexpressionlevelinlungtissues.F,IgElevelsinBALFandserum.G,IFN-γandIL-17AlevelsinBALF.H,Th2cytokines(IL-4,IL-5,andIL-13)levelsinspleencellsrestimulatedwith200μg/mlOVAfor72h.
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文20圖3致敏期間PepN處理減少了過敏性哮喘小鼠肺部CD11b+DCs數(shù)量Figure3AdministrationofPepNduringsensitizationreducednumberofCD11b+DCsinlungsofallergicasthmamiceA,RepresentativeflowdiagramshowingthelungcDCs(CD11c+MHCII+)andcDCssubsetspopulation.B,TotalnumbersoflungcDCsandcDCssubsets.C,Themeanfluorescenceintensity(MFI)ofCD40andCD86expressiononcDCs.D,ThepercentagesofCD40andCD86onCD11b+DCs.3.4在致敏期間處理PepN減少了過敏性哮喘小鼠肺CD11b+DCs相關趨化因子的水平為了進一步探究PepN對肺CD11b+DCs的影響，我們首先測量了過敏原暴露后負責募集DCs至肺的趨化因子的表達。CCL2和CCL8是CCR2的配體，CCR2是在炎癥性DCs上表達的趨化因子受體，因而CCL2和CCL8主要募集炎癥性DCs至肺部[18,30]。OVA致敏和激發(fā)誘導了肺CCL2和CCL8的mRNA表達水平增加，但PepN處理后兩者表達水平均保持不變（圖4A）。值得注意的是另一種趨化因子CCL20，負責募集未成熟DCs至肺部[17]，其mRNA表達水平在經PepN處理后顯著降低（圖4A）。與mRNA表達水平的變化保持一致，PepN也降低了過敏性哮喘小鼠BALF和肺勻漿中CCL20的蛋白水平（圖4B）。此外，在過敏性哮喘中，負責將效應Th2細胞募集至肺的趨化因子包括CCL17和CCL22，其來源主要為CD11b+DCs[17,20]。因此，我們檢測了小鼠肺組織中CCL17和CCL22的mRNA表達，結果顯示PepN處理后過敏性哮喘小鼠肺組織中CCL17和CCL22的mRNA
本文編號：3292881
【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市
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【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
重組蛋白PepN的制備Figure1PreparationofrecombinantproteinPepN
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文18圖2致敏期間PepN處理對OVA誘導的過敏性哮喘2型氣道炎癥的影響Figure2EffcetofadministrationofPepNduringsensitizationontype2airwayinflammationofOVA-inducedallergicasthmaA,Experimentalprotocol.B,TotalinflammatorycellsandeosinophilsinBALF.C,Th2cytokine(IL-5,andIL-13)levelsinBALF.D,PhotomicrographsofH&E-andPAS-stainedlungtissuesectionsofmice(400Xmagnification)andsemi-quantifiedPASscore.E,Muc5acmRNAexpressionlevelinlungtissues.F,IgElevelsinBALFandserum.G,IFN-γandIL-17AlevelsinBALF.H,Th2cytokines(IL-4,IL-5,andIL-13)levelsinspleencellsrestimulatedwith200μg/mlOVAfor72h.
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文20圖3致敏期間PepN處理減少了過敏性哮喘小鼠肺部CD11b+DCs數(shù)量Figure3AdministrationofPepNduringsensitizationreducednumberofCD11b+DCsinlungsofallergicasthmamiceA,RepresentativeflowdiagramshowingthelungcDCs(CD11c+MHCII+)andcDCssubsetspopulation.B,TotalnumbersoflungcDCsandcDCssubsets.C,Themeanfluorescenceintensity(MFI)ofCD40andCD86expressiononcDCs.D,ThepercentagesofCD40andCD86onCD11b+DCs.3.4在致敏期間處理PepN減少了過敏性哮喘小鼠肺CD11b+DCs相關趨化因子的水平為了進一步探究PepN對肺CD11b+DCs的影響，我們首先測量了過敏原暴露后負責募集DCs至肺的趨化因子的表達。CCL2和CCL8是CCR2的配體，CCR2是在炎癥性DCs上表達的趨化因子受體，因而CCL2和CCL8主要募集炎癥性DCs至肺部[18,30]。OVA致敏和激發(fā)誘導了肺CCL2和CCL8的mRNA表達水平增加，但PepN處理后兩者表達水平均保持不變（圖4A）。值得注意的是另一種趨化因子CCL20，負責募集未成熟DCs至肺部[17]，其mRNA表達水平在經PepN處理后顯著降低（圖4A）。與mRNA表達水平的變化保持一致，PepN也降低了過敏性哮喘小鼠BALF和肺勻漿中CCL20的蛋白水平（圖4B）。此外，在過敏性哮喘中，負責將效應Th2細胞募集至肺的趨化因子包括CCL17和CCL22，其來源主要為CD11b+DCs[17,20]。因此，我們檢測了小鼠肺組織中CCL17和CCL22的mRNA表達，結果顯示PepN處理后過敏性哮喘小鼠肺組織中CCL17和CCL22的mRNA
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