本文關鍵詞：乳凝集素改善壞死性小腸結腸炎腸道通透性及損傷修復的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:新生兒壞死性小腸結腸炎(Necrotizing enterocolitis,NEC)是早產(chǎn)兒常見的消化道進展性疾病,其發(fā)病機制不明,但與腸道屏障功能破壞密切相關。課題組前期實驗證明,乳凝集素可通過調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白,降低大鼠腸道屏障的通透性。本研究擬通過檢測乳凝集素對腸道緊密連接蛋白(Claudin-3和Occludin)的表達和分布,及腸道屏障修復相關蛋白(TLR4)表達等的影響,探討乳凝集素在改善NEC中的作用及可能機制。方法:第一部分動物實驗:(1)動物分組:一日齡新生大鼠被分為母乳組(DF組)、NEC模型組(N組)和NEC+rh MFG-E8組(N+M組),采用缺氧冷應激+配方奶侵襲性喂養(yǎng)的方法建立NEC模型,而N+M組在建立NEC模型的基礎上予以rh MFG-E8 100μg/天。(2)小腸形態(tài)學檢查:喂養(yǎng)96h后,處死新生大鼠,并觀察腸道外觀形態(tài),取小腸回盲部組織,進行組織病理學以及透射電鏡檢查。(3)腸道通透性檢測:各組新生大鼠于喂養(yǎng)結束后予以FITC標記的葡聚糖(FD10S),5h后采血,檢測血清中FITC的濃度來評估腸道屏障通透性。(4)腸道緊密連接蛋白表達分布水平檢測:通過Western blot、q RT-PCR和免疫組化的方法檢測小腸回盲部CLDN3和Occludin的分布情況。(5)腸道TLR4表達水平檢測:通過Western blot和q RT-PCR檢測小腸回盲部TLR4的表達情況。第二部分細胞實驗:(1)細胞分組:將IEC-6細胞分為PBS組(P組,對照組)、LPS組(L組,添加LPS 50μg/ml)和LPS+rh MFG-E8組(L+M組,在LPS組的基礎上添加rh MFG-E8 2μg/ml)。(2)細胞通透性檢測:利用transwell小室構建單層細胞模型,分組培養(yǎng)24h后上室內(nèi)添加FD10S,5h后取下室內(nèi)液體檢測FD10S的濃度評價各組細胞通透性。(3)細胞緊密連接蛋白的表達分布水平:細胞分組后培養(yǎng)24h,采取免疫熒光、Western blot和q RT-PCR檢查觀察CLDN3、Occludin和ZO-1蛋白的表達分布情況。(4)劃痕實驗:細胞分組后,采取劃痕的方法構建模型,記錄各組細胞于不同時間點(0h,6h,12h和24h)的遷移距離,評估遷移能力。結果:第一部分動物實驗:(1)乳凝集素對NEC新生大鼠臨床癥狀的影響N組的新生大鼠最早出現(xiàn)喂養(yǎng)不耐受(包括胃殘余量增加,進奶量下降等)、大便性狀改變等癥狀。添加rh MFG-E8后,與N組相比較,新生大鼠的胃殘余量減少,進奶量增加。(2)乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部形態(tài)學影響與N組相比較,添加rh MFG-E8的N+M組新生大鼠小腸回盲部輕中度積氣,未見節(jié)段性黑紅色壞死灶,其組織病理學評分及NEC陽性率顯著降低(P0.05)。透射電鏡下,N組新生大鼠小腸回盲部腸黏膜隱窩部上皮細胞空泡化明顯,細胞質(zhì)呈深色,胞漿濃縮,細胞體積縮小,細胞間結構松散,可見典型凋亡細胞。而N+M組僅見細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)不同程度的積聚,核膜邊集,線粒體腫脹。(3)乳凝集素對NEC新生大鼠腸道通透性及CLDN3、Occludin和TLR4表達分布的影響與N組相比較,N+M組新生大鼠腸道通透性顯著降低(P0.05),CLDN3胞內(nèi)分布由胞漿內(nèi)彌散分布變?yōu)樵诎ど蠞饩�。同時,其小腸回盲部TLR4表達水平較N組顯著降低(P0.05)。第二部分細胞實驗:(1)乳凝集素對LPS處理后IEC-6細胞通透性和緊密連接蛋白表達分布水平的影響與LPS組相比較,L+M組表觀滲透系數(shù)(Papp)顯著降低(P0.05),趨近P組,其CLDN3的表達水平顯著降低(P0.05),同時ZO-1由胞漿內(nèi)彌散分布變?yōu)樵诎ど蠞饩郾磉_。(2)乳凝集素對LPS處理后IEC-6細胞遷移能力的影響與LPS組相比較,添加rh MFG-E8的L+M組于給藥后12h時間點的水平遷移距離顯著增加(P0.05),趨近P組。結論:(1)乳凝集素能夠改善NEC新生大鼠小腸回盲部外觀形態(tài)、組織學評分及超微結構,降低NEC的發(fā)生率和嚴重程度。(2)乳凝集素能使NEC新生大鼠小腸回盲部CLDN3蛋白重新分布,使其在細胞膜上濃聚,同時降低TLR4的表達水平,從而降低腸道通透性,提高腸道損傷修復能力,維持腸道屏障的穩(wěn)態(tài)。(3)乳凝集素能降低LPS處理后的IEC-6細胞CLDN3蛋白表達水平,同時使ZO-1蛋白重新分布,使其在細胞膜上濃聚,從而改善細胞通透性。(4)乳凝集素能增強經(jīng)LPS處理后IEC-6細胞的遷移能力,從而促進腸上皮細胞修復能力。
【關鍵詞】：壞死性小腸結腸炎 乳凝集素 腸道通透性 緊密連接 遷移
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R722.6
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞表14-15
• 緒論15-18
• 第一部分 乳凝集素對新生大鼠壞死性小腸結腸炎腸道屏障通透性及損傷修復相關蛋白TLR4的影響18-46
• 1.1 材料和方法18-31
• 1.1.1 實驗動物18
• 1.1.2 儀器設備18-19
• 1.1.3 試劑耗材19-20
• 1.1.4 試劑配備20-22
• 1.1.5 實驗方法22-31
• 1.1.5.1 重組人乳凝集素的表達和純化22
• 1.1.5.2 NEC新生大鼠模型的制備22-23
• 1.1.5.3 實驗動物分組23-24
• 1.1.5.4 腸道通透性檢測24
• 1.1.5.5 動物實驗取材24
• 1.1.5.6 新生大鼠小腸回盲部組織形態(tài)學分析24-27
• 1.1.5.6.1 新生大鼠小腸回盲部組織HE染色檢查24-26
• 1.1.5.6.2 新生大鼠小腸回盲部透射電鏡檢查26-27
• 1.1.5.7 新生大鼠小腸回盲部免疫組化檢查27-28
• 1.1.5.8 新生大鼠小腸回盲部Western blot檢測28-30
• 1.1.5.9 新生大鼠小腸回盲部real-time PCR檢測30-31
• 1.1.6 統(tǒng)計學分析31
• 1.2 結果31-42
• 1.2.1 乳凝集素對NEC新生大鼠臨床癥狀的影響31
• 1.2.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部形態(tài)學影響31-35
• 1.2.2.1 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部外觀形態(tài)的影響31-32
• 1.2.2.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部HE染色的影響32-34
• 1.2.2.3 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部超微結構的影響34-35
• 1.2.3 乳凝集素對NEC新生大鼠腸道屏障的影響35-42
• 1.2.3.1 乳凝集素對NEC新生大鼠腸道通透性的影響35
• 1.2.3.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部腸道緊密連接蛋白CLDN3和Occludin表達分布的影響35-40
• 1.2.3.2.1 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部緊密連接蛋白CLDN3表達分布的影響35-38
• 1.2.3.2.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部緊密連接蛋白Occludin表達分布的影響38-40
• 1.2.3.3 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部TLR4表達的影響40-42
• 1.2.3.3.1 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部TLR4蛋白表達的影響40-41
• 1.2.3.3.2 乳凝集素對NEC新生大鼠小腸回盲部TLR4 mRNA表達的影響41-42
• 1.3 討論42-46
• 第二部分 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細胞屏障通透性及細胞遷移能力的影響46-66
• 2.1 材料和方法46-54
• 2.1.1 儀器設備46-47
• 2.1.2 試劑耗材47-48
• 2.1.3 試劑配備48-50
• 2.1.4 實驗方法50-54
• 2.1.4.1 重組人乳凝集素的表達和純化50
• 2.1.4.2 IEC-6 細胞株的培養(yǎng)傳代50
• 2.1.4.3 細胞分組50
• 2.1.4.4 單層IEC-6 細胞通透性檢測50-51
• 2.1.4.5 劃痕實驗51
• 2.1.4.6 細胞Western blot檢測51-52
• 2.1.4.7 細胞real-time PCR檢測52-53
• 2.1.4.8 細胞免疫熒光檢測53-54
• 2.1.5 統(tǒng)計學分析54
• 2.2 結果54-64
• 2.2.1 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細胞屏障的影響54-63
• 2.2.1.1 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細胞通透性的影響54-55
• 2.2.1.2 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細胞緊密連接蛋白CLDN3、Occludin和ZO-1 表達分布的影響55-63
• 2.2.1.2.1 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細胞緊密連接蛋白CLDN3表達分布的影響55-58
• 2.2.1.2.2 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細胞緊密連接蛋白Occludin表達分布的影響58-61
• 2.2.1.2.3 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細胞緊密連接蛋白ZO-1 表達分布的影響61-63
• 2.2.2 乳凝集素對LPS處理后IEC-6 細胞遷移能力的影響63-64
• 2.3 討論64-66
• 結論66-67
• 參考文獻67-71
• 致謝71-73
• 附錄一：綜述73-84
• 參考文獻79-84
• 附錄二：已刊文章目錄84

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本文編號：292778