目的： 早產兒腦白質損傷(white matter damage, WMD)被認為是早產兒最主要也是最重要的腦損傷。WMD的關鍵性靶細胞是少突膠質前體細胞。最近有學說指出WMD的發(fā)病機制中存在少突膠質前體細胞分化障礙。流行病學和動物實驗研究均表明宮內感染是早產兒WMD發(fā)生的主要因素之一。神經免疫應答反應被認為在宮內感染和早產兒WMD中起重要的介導作用。但具體的分子機制目前還不明確。 Toll樣蛋白的研究是近年來炎癥信號傳導領域取得的最重要進展。Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)激活后通過誘導一系列炎性相關因子的表達調控機體固有性免疫應答,并最終激活適應性免疫應答。研究指出TLR-4信號通路參與缺血性腦梗塞、腦挫傷、帕金森氏病、蛛網膜下腔出血、多發(fā)性硬化、缺氧性腦損傷等一系列免疫應答相關性腦損傷的發(fā)生。因此有學者提出：神經免疫應答過程中小膠質細胞TLR-4信號的表達啟動在腦內防御反應及腦損傷的平衡機制中起重要作用。最新的研究還指出TLR-4信號能直接激活經典的notch1信號通路分子。而Notch1信號通路通過其下游目的基因Hes (Hairy enhancer of split)基因家族(如Hes1、Hes5等)對少突膠質細胞分化起到重要的負性調控作用。 目前國內外對于TLR-4信號在宮內感染致WMD發(fā)生中作用的研究不多,且多集中在離體水平上。過去幾年間,我們實驗室通過子宮頸內接種大腸桿菌的方式成功建立了宮內感染致新生大鼠WMD的動物模型�；谶@一成熟模型,本研究觀察宮內感染后仔鼠腦內TLR-4信號分子表達。并通過檢測相關下游細胞因子、少突膠質細胞分化負性調控因子,進一步探討TLR-4信號在宮內感染致WMD中的作用機制。該研究為臨床治療早產兒WMD提供豐富的動物實驗信息及依據,為今后相關領域深入研究奠定整體動物實驗基礎,并為進一步研究早產兒WMD的防治提供新的靶點。 方法： 1.實驗分組：將孕鼠隨機分為對照組、宮內感染組。宮內感染組孕齡15天的孕鼠宮頸左右兩側各注射大腸桿菌稀釋液0.2 ml,對照組同孕齡孕鼠注入等量生理鹽水。 2.標本采集：選擇17、19、21天胎齡和新生1、3、7、14日齡為觀察時點,剖腹取出胎鼠或者隨機選取各組新生仔鼠斷頭處死,取出腦組織置于10%中性甲醛或液氮速凍后-80℃超低溫冰箱中冷凍保存。 3.實驗方法：測定各時點仔鼠體重、腦重。應用蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色觀察各組新生1、3、7、14日齡大鼠腦室周圍白質組織病理變化特點。Western blot檢測各時點仔鼠腦組織髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)、TLR-4和核因子kappa B p65 (nuclear factor-kappa B p65, NF-κB p65)的蛋白表達水平,熒光定量RT-PCR檢測各時點仔鼠腦內TLR-4、NF-κB p65、細胞因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α.白細胞介素(interieukin, IL)-1β、Notch1、Hes5 mRNA的表達。 結果： 1.44只孕鼠活動、進食均正常,無1例發(fā)生死亡、早產。仔鼠情況：對照組獲取新生仔鼠66只,17、19、21天胎齡仔鼠56、55、58只,死產2只,死胎7只；宮內感染組獲取新生仔鼠70只,17天、19天、21天胎齡仔鼠57、58、56只,死產5只,死胎8只。 宮內大腸桿菌感染的孕鼠子宮壁及胎盤內血管充血、水腫,并見大量中性粒細胞浸潤。對照組的孕鼠子宮及病理檢測均未見明顯的炎癥反應。 2.宮內感染后,各時點胎鼠及1日齡仔鼠體重、腦重下降. 3.7、14日齡仔鼠腦室周圍白質部位HE染色可見：對照組腦白質組織結構正常,染色清晰；宮內感染組腦白質染色淡,結構稀疏呈篩網狀改變。 4.對照組14日齡仔鼠腦組織出現MBP表達,宮內感染組14日齡仔鼠腦組織MBP表達減少甚至消失。 5.宮內感染后TLR-4及其下游信號分子NF-κB p65表達在17日胎齡及1、3、7日齡仔鼠腦內同步化上調。 6.宮內感染后19、21天胎齡仔鼠腦內TNF-α表達上調。 7.宮內感染后Notchl及其下游信號分子Hes5表達在19日胎齡及1、3、7日齡仔鼠腦內同步化上調。 結論： 1.宮內感染可使胎鼠體重、腦重下降。 2.TLR-4信號可能參與宮內感染致WMD的發(fā)生。 3.TLR-4信號可能通過調控細胞因子的的表達部分介導宮內感染后WMD的發(fā)生。 4.TLR-4信號在宮內感染致腦白質病變的發(fā)生中的作用可能部分源于激活的Notchl信號阻礙少突膠質細胞前體分化。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R722.1
【部分圖文】：

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本文編號：2892438