心臟錐干部畸形是常見(jiàn)的復(fù)雜性先天性心臟病(先心病)，是導(dǎo)致兒童死亡的主要原因之一。近端流出道隔對(duì)錐干部的發(fā)育至關(guān)重要。細(xì)胞縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)基因敲除(Cx43KO)小鼠心臟錐干部發(fā)育畸形，流出道梗阻，生后即出現(xiàn)死亡，表明Cx43在心臟流出道發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。Cx43是連接蛋白家族中的重要一員，作為一種重要的通訊連接，是細(xì)胞間代謝偶聯(lián)、沖動(dòng)傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)Cx43KO小鼠心臟近端流出道隔心肌化過(guò)程異常，提示復(fù)雜的分子機(jī)制參與心臟流出道梗阻的發(fā)生。為此，本課題擬研究Cx43KO小鼠胚胎心臟近端流出道組織中基因表達(dá)譜的改變，篩選可能導(dǎo)致Cx43KO小鼠心臟流出道梗阻的相關(guān)基因，進(jìn)一步闡述Cx43KO小鼠心臟流出道梗阻的發(fā)病機(jī)制。 第一部分Cx43基因敲除小鼠心臟發(fā)育心肌化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)研究 研究目的 利用Cx43基因敲除小鼠模型，探討Cx43基因敲除小鼠與野生型小鼠在心臟心肌化發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)差異。 材料與方法 成年2月齡Cx43基因敲除雜合子小鼠交配，選取ED11.5～ED15.5天的胎鼠以及新生小鼠為研究對(duì)象，根據(jù)基因型分為Cx43基因敲除純合子(Cx43-／-)、雜合子(Cx43＋／-)及野生型(Cx43＋／＋)，采用PCR方法鑒定基因型。顯微解剖及HE染色觀察心臟結(jié)構(gòu)；免疫組織化學(xué)法測(cè)定橫紋肌肌動(dòng)蛋白α-SCA的表達(dá)。 結(jié)果 1．所有Cx43-／-小鼠出生后很快死亡，其心臟大體解剖上可見(jiàn)右室流出道圓錐部明顯膨出。Cx43＋／-新生鼠心臟無(wú)明顯異常。 2．組織切片HE染色顯示，出生后很快死亡的Cx43-／-小鼠右室流出道圓錐部組織異常增生，小梁間囊明顯，結(jié)構(gòu)排列紊亂，流出道腔縮窄，右室壁心肌致密層的厚度較野生型明顯變薄。Cx43＋／-新生鼠心臟無(wú)明顯異常。 3．野生型胎鼠心臟近端流出道心內(nèi)膜墊組織于ED11.5天開始有融合趨勢(shì)，ED13.5天完成融合；心肌化過(guò)程從ED12.5天開始，ED15.5天完成。整個(gè)心肌化過(guò)程呈現(xiàn)心肌由流出道隔外側(cè)向內(nèi)側(cè)的生長(zhǎng)趨勢(shì)。而在Cx43-／-胎鼠，α-SCA在近端流出道隔心內(nèi)膜墊組織的表達(dá)減少，尤其是在ED13.5～ED15.5天為著，說(shuō)明心肌化過(guò)程延遲。Cx43＋／-的變化不明顯。 小結(jié) 1．Cx43-／-小鼠以右室流出道異常增生引起的梗阻性畸形為主要表型特征。 2．Cx43-／-小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化遲滯。 第二部分Cx43基因敲除胎鼠心肌化過(guò)程中心臟流出道組織中基因表達(dá)譜的變化 研究目的 觀察Cx43-／-小鼠胚胎心臟近端流出道組織中基因表達(dá)譜的改變，篩選可能導(dǎo)致Cx43-／-小鼠流出道梗阻的相關(guān)基因。 材料與方法 以ED14.5天的Cx43-／-和Cx43＋／＋胎鼠心臟近端流出道部為研究材料，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；并在體外轉(zhuǎn)錄為cRNA，同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記及片段化；再與Affymetrix 430 2.0基因芯片進(jìn)行雜交。雜交信號(hào)經(jīng)掃描后，應(yīng)用相關(guān)生物信息軟件分析基因表達(dá)情況。對(duì)芯片檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的4個(gè)Galpha13信號(hào)通路上的基因，在ED11.5～ED15.5期間用Realtime RT-PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 1．與Cx43＋／＋組相比較，Cx43-／-組中表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因共有287個(gè)，表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有199個(gè)。其中表達(dá)差異的基因參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期等主要生理過(guò)程。 2．進(jìn)一步篩查發(fā)現(xiàn)，Galpha13信號(hào)通路上的多個(gè)基因在Cx43-／-組有明顯變化。 3．Realtime RT-PCR驗(yàn)證其中的4個(gè)基因包括RhoA、Rac1、Calm1及Rock-1的變化，表明其變化趨勢(shì)基本與基因芯片結(jié)果相同。 小結(jié) 1．Cx43基因敲除后可以引起多個(gè)基因的表達(dá)異常，其中包括與流出道發(fā)育密切相關(guān)的一些基因。 2．Cx43-／-胎鼠心臟流出道組織中Galpha13信號(hào)通路RhoA、Rac1、Calm1及Rock-1等基因的差異表達(dá)可能與其流出道梗阻的發(fā)生相關(guān)。 第三部分Rock-1在胎鼠心臟流出道隔的表達(dá)規(guī)律及其在Cx43基因敲除胎鼠心臟流出道隔表達(dá)的變化 研究目的 觀察Rho相關(guān)卷曲蛋白激酶Rock-1在小鼠胚胎心臟流出道發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，探討其在胚胎心臟流出道隔心肌化過(guò)程中的作用。 材料與方法 選用ED11.5至ED15.5天的Cx43＋／＋和Cx43-／-小鼠，用免疫組織化學(xué)方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Rock-1在胚胎不同發(fā)育時(shí)期流出道部位的表達(dá)，比較分析兩組胎鼠心臟流出道組織中該基因表達(dá)的差異。 結(jié)果 1．Rock-1蛋白的表達(dá)主要局限在胚胎心臟近端流出道隔組織中，其表達(dá)的部位隨胎齡的變化與α-SCA有類似之處。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法顯示Rock-1基因從ED11.5即開始在流出道組織中表達(dá)，以后在ED13.5～ED14.5表達(dá)量達(dá)到高峰。這與胚胎心臟近端流出道心肌化的高峰時(shí)間吻合。 2．在近端流出道隔心肌化的ED11.5～ED15.5時(shí)期，隨著Cx43-／-組流出道隔心肌化過(guò)程的延遲，免疫組化和Realtime RT-PCR均顯示該組Rock-1的表達(dá)從ED13.5開始較Cx43＋／＋組明顯減少，并持續(xù)至ED15.5天。 小結(jié) 1．Rock-1在心臟流出道組織中的時(shí)空表達(dá)模式與以α-SCA標(biāo)記的心肌化過(guò)程極為相似，提示其可能參與了心肌化過(guò)程。 2．Cx43-／-胎鼠Rock-1的表達(dá)量下降可能與其流出道隔的心肌化延遲有關(guān)。 總結(jié) Cx43基因敲除純合子小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化遲滯，提示Cx43在心肌化的發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。利用基因芯片技術(shù)初步篩選出與Cx43-／-胎鼠心臟近端流出道發(fā)育畸形有關(guān)的多個(gè)基因，其中Galpha13信號(hào)通路上相關(guān)基因的表達(dá)異�？赡芘cCx43-／-小鼠流出道梗阻的發(fā)生有關(guān)。而Rock-1基因在心肌化過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，其表達(dá)量的下調(diào)可能是Cx43-／-胎鼠心臟近端流出道隔心肌化延遲的原因之一。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：

17.525PCR所需引物:參考以往文獻(xiàn)設(shè)計(jì)117]，見(jiàn)圖1一1和表1一1。W宜如OUSTarg的 ngv.的or MetGlyArg!Ie·cX條MU協(xié)泊心協(xié)瀏6圖1一 1Cx43KO小鼠基因敲除技術(shù)圖注:正常小鼠Cx43基因編碼區(qū)包含在exonZ內(nèi)，編碼區(qū)前有啟動(dòng)子;通過(guò)設(shè)計(jì)一個(gè)沒(méi)有啟動(dòng)子的neo基因載體，將其導(dǎo)入小鼠的胚胎干細(xì)胞中;由于缺乏啟動(dòng)子，導(dǎo)致Cx43基因不表達(dá)。表1一 1Cx43KO小鼠基因型鑒定引物序列檢測(cè)位點(diǎn)Cx43WT引物名稱Cx43一5”Cx43一3’上下游引物序列(5’一3’)產(chǎn)物長(zhǎng)度 CCCDACTCTCACCl人 TGTCTCC500bPACTI一l一 1GCCGCCTAGCTATCCCNeo一5’ GCTTGCCGAATATCATGGTGGACx43KOIkbCx43一3’ACTI一l一 1GCCGCCI… AGCl’ ATCCC

(Cx43+/+)位點(diǎn)的片段。引物Cx43一3’和引物Neo一5’擴(kuò)增出一條約Ikb的基因敲除(cx43一八)位點(diǎn)的片段。僅有一條soobp的片段者為cx43+/+，僅有一條Ikb片段者為Cx43一八，兩條都有者為雜合子(Cx43十產(chǎn))。(見(jiàn)圖1一2)M盯ker一/-+/++/-2kbIkb500bP圖1一2新生小鼠基因型鑒定pCR產(chǎn)物電泳圖注:PcR產(chǎn)物中含有 1kb和50obP片段的是cx43雜合了(+/一);只含有Ikb的是cx43基因敲除鼠(一八);只含有500bp的是野生型(+/+)。八、檢測(cè)指標(biāo)及方法顯微解剖觀察心臟的大體結(jié)構(gòu);常規(guī)HE染色做組織病理學(xué)檢查;采用免疫組化ABC法測(cè)定橫紋肌肌動(dòng)蛋白a一SCA的表達(dá)。具體方法如下:1.HE染色:按常規(guī)方法進(jìn)行。

幾乎所有的Cx43一八小鼠出生后很快死亡。從大體解剖上我們可以看出，Cx43一八新生小鼠心臟的右室流出通段明顯膨出:而_且由于流出道部分明顯的膨出導(dǎo)致主、肺動(dòng)脈較正常時(shí)的位置后移(圖1一3)。Cx43雜合子新生鼠心臟無(wú)明顯圖1一3野生型和Cx43基因敲除純合子新生小鼠心臟外觀差別注:A、B分別為Cx4:3+/十(野生型)和Cx43一產(chǎn)(Cx43基因敲除純合了)新生小鼠心臟。綠、黃色星號(hào)分別表示主、月巾動(dòng)脈。(LA=左心房，隊(duì)=右心房，Lv二左心室，RV二右心室，orT=右室流出道。Ba門00卜m)二、HE染色顯示野生型和cx43一八新生小鼠心臟橫切面各平面差別新生小鼠心臟不同層面橫斷血組織切片HE染色顯示:出生后很快死一亡的Cx43一八小鼠右室流出道圓錐部組織異常增生，小梁間囊明顯，結(jié)構(gòu)排列紊亂，流出逆腔縮窄，右室壁心肌致密層的厚度較野生型明顯變薄。主、肺動(dòng)脈之間的夾角關(guān)系和野生型相比有所差異(圖1一4)。Cx43雜合子新生鼠心臟無(wú)明顯異常。三、免疫組化顯示野生型和Cx43一八胎鼠各時(shí)間段近端流出道隔橫紋肌肌動(dòng)蛋白。一SCA的表達(dá)差異在野生型胎鼠心臟，其近端流出道心內(nèi)膜墊組織于EDll.5開始有融合趨勢(shì)
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本文編號(hào)：2876976