發(fā)布時間：2020-10-18 17:08

　　 第一部分兒童急性T淋巴細胞白血病中GPCRs表達紊亂目的:通過高通量RNA轉錄組測序(High through-put RNA sequencing,RNA-seq)檢測兒童急性T淋巴細胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)腫瘤細胞中差異表達的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)基因。方法:收集13例初發(fā)兒童T-ALL骨髓樣本,通過Ficoll淋巴細胞分離液分離T-ALL腫瘤細胞;收集4例健康兒童外周血樣本,通過人T細胞提取試劑盒分離正常T細胞;提取T-ALL腫瘤細胞及正常T細胞RNA,進行RNA-seq,檢測基因mRNA表達水平;通過R語言分析TALL腫瘤細胞及正常T細胞差異表達基因并繪制差異表達基因熱圖及火山圖;通過Gene Ontology對差異表達基因進行GO分析。結果:RNA-seq分析結果顯示,相對于健康兒童外周血正常T細胞,13例T-ALL患兒骨髓腫瘤細胞中存在大量腫瘤相關通路基因表達異常;大量GPCRs表達異常;差異表達GPCRs進行GO分析,存在其中鞘氨醇-1-磷酸鹽(Sphingosine-1-Phosphate,S1P)信號通路相關基因富集。結論:兒童急性T淋巴細胞白血病骨髓細胞中存在大量異常表達的GPCRs基因,其中S1P信號通路相關基因異常富集。第二部分S1PR3在兒童急性T淋巴細胞白血病中表達增加目的:分析RNA-seq數(shù)據(jù)S1P信號通路相關基因表達情況;通過查詢GEO數(shù)據(jù)庫分析多組T-ALL研究數(shù)據(jù)S1P信號通路相關基因的表達;在T-ALL細胞系及病人樣本中對S1P信號通路相關基因進行驗證。方法:分析RNA-seq數(shù)據(jù)中S1P信號通路相關基因的表達情況。檢索GEO數(shù)據(jù)庫,分析多個研究組數(shù)據(jù)T-ALL中S1P信號通路相關基因表達情況。收集初發(fā)兒童T-ALL骨髓上清及非腫瘤患者骨髓,通過ELISA檢測骨髓上清S1P及其運載體載脂蛋白M(Apolipoprotein M,Apo M)表達。通過GEO數(shù)據(jù)庫,分析T-ALL細胞中S1P信號通路相關基因的表達情況。收集健康兒童外周血,人T細胞提取試劑盒提取正常T細胞;收集健康兒童胸腺組織,研磨、過濾后獲得胸腺細胞;收集非腫瘤患者骨髓,Ficoll淋巴細胞分離液單個核細胞,進一步磁珠分選得CD34+骨髓細胞;收集初診兒童T-ALL骨髓樣本,Ficoll淋巴細胞分離液分離T-ALL腫瘤細胞;培養(yǎng)T-ALL各細胞系細胞;提取細胞RNA,通過Q-PCR檢測正常T細胞、CD34+骨髓細胞及T-ALL細胞系中SPHK1、SPHK2及SGPL1的表達水平。通過Q-PCR檢測正常T細胞、正常胸腺細胞、CD34+骨髓細胞及T-ALL細胞系中S1PR3的表達水平。通過流式細胞儀檢測T-ALL細胞系細胞膜S1PR3的表達水平。通過Q-PCR檢測外周血T細胞、臨床T-ALL腫瘤細胞S1PR3表達情況。結果:RNA-seq發(fā)現(xiàn)與正常T細胞相比,S1P合成酶SPHK2在TALL腫瘤細胞中表達增加,S1P降解酶SGPL1表達下降,S1PR3在TALL腫瘤細胞中表達顯著增加,S1PR1、S1PR2、S1PR4及S1PR5表達相對減少。GEO數(shù)據(jù)庫多個T-ALL研究組數(shù)據(jù)顯示,T-ALL腫瘤細胞S1PR3表達顯著增加,SPHK1、SPHK2表達相對增加,S1PR1、S1PR2、S1PR4及S1PR5表達相對減少,SGPL1表達相對減少。ELISA檢測結果顯示T-ALL骨髓上清中S1P及Apo M表達無明顯差異。GEO數(shù)據(jù)庫分析及Q-PCR驗證結果顯示,與外周血T細胞、胸腺細胞、CD34+骨髓細胞相比,T-ALL細胞系S1PR3表達顯著增加,SPHK2表達增加,SGPL1表達下降。流式細胞儀結果顯示T-ALL細胞系中,JK細胞表面S1PR3表達最高,其次為CEM、MOLT4、CUTLL1。臨床患者腫瘤細胞Q-PCR結果顯示,T-ALL中S1PR3的表達水平顯著增加。結論:分析GEO數(shù)據(jù)庫T-ALL相關研究、同時在T-ALL細胞系及病人樣本中進行驗證,發(fā)現(xiàn)S1P信號通路相關基因在T-ALL差異表達,其中S1PR3表達顯著增加。第三部分抑制S1PR3促進兒童急性T淋巴細胞白血病細胞凋亡目的:檢測S1PR3分子在體外對T-ALL細胞凋亡的作用方法:通過S1PR3特異性小分子抑制劑TY52156(0、1、3、7、10、15u M)、CAY10444(0、3、5、10、20、30u M)分別作用于T-ALL細胞系,通過Annexin V-APC/7-AAD染色,流式細胞儀檢測細胞凋亡。收集并培養(yǎng)原代T-ALL病人腫瘤細胞,CAY10444(0、3、5、10、20、30u M)作用后Annexin V-APC/7-AAD染色,流式細胞儀檢測抑制細胞凋亡,激光共聚焦觀察Cleaved-caspase3+細胞比例。通過TY52156(0、7、15u M)、CAY10444(0、10、30u M)分別作用于CD34+骨髓細胞,通過Annexin V-APC/7-AAD染色,流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果:流式細胞儀檢測結果顯示,S1PR3特異性小分子抑制劑可顯著促進T-ALL細胞凋亡,凋亡比例呈藥物濃度依賴性;TY52156作用于CEM、MOLT4、JK、CUTLL1的IC50分別為5.23u M、5.78 u M、5.93u M、6 u M。CAY10444作用于CEM、MOLT4、JK、CUTLL1的IC50分別為10.12 u M、13.17 u M、21.59 u M、27.22 u M。S1PR3特異性小分子抑制劑CAY10444作用于1例原代T-ALL病人腫瘤細胞,在30u M時引起88%白血病細胞凋亡。S1PR3特異性小分子抑制劑CAY10444作用于1例原代T-ALL病人腫瘤細胞,激光共聚焦觀察Cleaved-caspase3+細胞比例隨藥物濃度逐漸增加。流式細胞儀檢測結果顯示,S1PR3特異性小分子抑制劑TY52156、CAY10444分別對CD34+骨髓細胞凋亡無明顯影響。結論:特異性抑制S1PR3促進T-ALL細胞凋亡。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R733.71
【部分圖文】：

18圖 1.1 RNA-seq 檢測 T-ALL 患者腫瘤細胞基因表達Figure 1.1 The gene expression of the clinical patient’s T-ALL cells detected by RNA-seq2.2 與正常 T 細胞相比，T-ALL 腫瘤細胞存在大量異常表達的GPCRs為進一步分析 T-ALL 腫瘤細胞中異常表達的 GPCRs，從 GPCRdb 數(shù)據(jù)庫檢索出現(xiàn)有的約 900 個 GPCRs，通過 R 語言對 RNA-seq 數(shù)據(jù)中的 GPCRs 進行基因差異

圖 2.1 T-ALL 臨床標本中 S1P 信號通路相關基因的表達Figure 2.1 The mRNA expression of S1P signal related genes in the clinical T-ALL samples.2.2 檢索 GEO 數(shù)據(jù)庫，多組 RNA-seq 數(shù)據(jù)中 S1P 信號通路相關基因表達紊亂為進一步明確 S1P 信號通路相關基因在 T-ALL 樣本中的表達情況，GEO 數(shù)據(jù)庫檢索多中心 RNA-seq 數(shù)據(jù)，通過 R 語言進行基因差異表達分析。結果顯示，GSE48558 組（T-ALL 13 例，Ctrl 17 例）中 T-ALL 細胞 SPHK2 表達增加（圖2.2A），S1PR1、S1PR4、S1PR5 表達下降， S1PR3 表達顯著增加（圖 2.2B）。GSE66638 組（T-ALL 8 例，Ctrl 2 例）中 SPHK2 表達增加（圖 2.2C），S1PR3 表達無統(tǒng)計學差異。上述結果與我們的 RNA-seq 數(shù)據(jù)基本吻合，均提示，T-ALL 細胞

圖 2.2 GEO 數(shù)據(jù)庫 T-ALL 臨床標本中 S1P 信號通路相關基因的表達Figure 2.2 The mRNA expression of S1P related genes in the clinical T-ALL samples from GEOdatabase.2.3 S1P 及其運載體 ApoM 在 T-ALL 病人樣本中表達無明顯差異為驗證 T-ALL 臨床樣本中 S1P 及其運載體表達情況，我們收集了 5 例非腫瘤童骨髓樣本及 8 例初診兒童 T-ALL 骨髓上清，通過 ELISA 檢測 S1P 及 ApoM 水平。結果顯示兩組間 S1P 及 ApoM 的表達無明顯差異（圖 2.3A、B），提示 S1P 在患者骨髓中無異常。由于收集骨髓過程中樣本多發(fā)生了溶血，而 S1P 為紅細胞內(nèi)產(chǎn)生，推測 S1P 的檢測不準確，不能排除 S1P 在患者骨髓中異常。
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本文編號：2846575