先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung disease,HD)又稱腸無神經(jīng)節(jié)細胞癥,是一種神經(jīng)嵴細胞源性疾病和多基因遺傳病,其主要病因是患兒在胚胎期神經(jīng)發(fā)育過程中,神經(jīng)嵴細胞遷移障礙,腸神經(jīng)發(fā)育出現(xiàn)停頓,腸壁肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)細胞缺失,以致受累腸段異常收縮,其近端結(jié)腸代償性擴張與肥厚,形成巨結(jié)腸。HD是新生兒期低位腸梗阻常見原因之一,發(fā)病率占成活新生兒的1/5000。 在先天性巨結(jié)腸癥患者中,70%的患者為單發(fā),12%的病例合并常染色體疾病,18%的病例合并有其他先天性畸形。對單純性HD的研究表明,HD患者同胞的發(fā)病根據(jù)性別和無神經(jīng)節(jié)腸段的長度不同,其再發(fā)病率為1%～33%,因此HD被認為是性修飾多因素遺傳病。其中基因因素的影響發(fā)揮著非常重要的作用。至今為止已發(fā)現(xiàn)原癌基因RET以及分別編碼膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial calline-derined neurotrophic factor,GDNF),內(nèi)皮素B受體(endothelinβreceptor,EDNRB),內(nèi)皮素3(endothelin3,EDN3),內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1(endothelin convertingenzyme 1,ECE1),neurturin(NTN),轉(zhuǎn)錄因子SOX10以及SIP1(smad-interactingproteinl)等基因與HD有關(guān)。同時微環(huán)境變化導致神經(jīng)嵴細胞分化障礙引起HD這一學說越來越引起人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)很多促進軸突生長和/或生長導向因子,如神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子、細胞粘附因子(CAMs),其中, CAM可通過介導細胞一細胞之間的相互作用而調(diào)節(jié)多種細胞的生長和發(fā)育;神經(jīng)系統(tǒng)中,其特有的細胞粘附因子NCAM、L1CAM、N-cadherin對于神經(jīng)元網(wǎng)絡的形成,包括神經(jīng)元的遷移、神經(jīng)細胞軸突的生長以及軸突的束狀成形是必不可少的�，F(xiàn)在已充分地認識到FGFR-CAM同源性結(jié)構(gòu)域在所有FGFRs與N-cadherin,NCAM以及L1CAM間具有高度的保守性。 一、細胞粘附分子CAMs在先天性巨結(jié)腸中的表達研究有些神經(jīng)節(jié)細胞缺如是神經(jīng)嵴細胞移行到正常位置后由于微環(huán)境變化導致分化障礙而引起的。軸突的方向性生長與微環(huán)境密切相關(guān)是突觸形成的基礎(chǔ)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多促進軸突生長和/或生長導向因子,如神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子、細胞粘附因子(CAMs)如NCAM,L1CAM以及N-calherin等。細胞粘附因子(CAM)通過介導細胞-細胞之間的相互作用而調(diào)節(jié)多種細胞的生長和發(fā)育,近來有研究發(fā)現(xiàn)CAM通過與成纖維細胞生長因子受體(FGFR)結(jié)合(CAM-FGFR信號傳遞)途徑而刺激神經(jīng)元突起的生長。 鑒于考慮CAM-FGFR信號傳遞發(fā)生改變可能是導致HD主要神經(jīng)元異常的原因之一,本課題選取NCAM、N-cadherin兩種細胞粘附分子,研究它們在HD腸壁中的表達情況,初步探討CAM-FGFR信號傳導在HD致病機理中的作用。我們根據(jù)HE和AchE染色,將16例HD患者的標本分別分為神經(jīng)節(jié)正常腸段(ganglionic segments,NG)和神經(jīng)節(jié)缺如腸段(aganglionic segments,AG)兩組,進行免疫組織化學染色。觀察了HD患者細胞粘附分子(CAMs)分別在HD神經(jīng)節(jié)正常腸段和神經(jīng)節(jié)缺如腸段的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞粘附分子NCAM在神經(jīng)組織和平滑肌組織中都有表達,但NG腸段腸組織中NCAM染色的正常的神經(jīng)纖維的數(shù)量明顯多于AG腸段;細胞粘附分子N-cadherin在神經(jīng)組織和平滑肌中也都有表達,且同樣在NG腸段平滑肌中N-cadherin染色的正常的神經(jīng)纖維數(shù)量明顯要多。結(jié)果表明細胞粘附分子(CAMs)在AG腸段的明顯減少說明HD患者中CAM-FGFR信號傳導發(fā)生了異常,且可能是導致腸神經(jīng)母細胞移行障礙的原因之 二、RET基因多態(tài)性與中國漢族人群先天性巨結(jié)腸的相關(guān)性研究 相對環(huán)境而言,遺傳因素在HD發(fā)生中起著更為重要的作用。RET原癌基因是最早發(fā)現(xiàn),證據(jù)最確鑿,作用最重要的與HD相關(guān)的基因。它定位于10q11.2,長約80kb,有20個外顯子,編碼產(chǎn)物為酪氨酸蛋白激酶受體。目前在HD病人中發(fā)現(xiàn)RET的突變性分散,無熱點區(qū)域存在,極少數(shù)為大片段缺失,多為點突變、錯義、無義和移碼突變。20個外顯子中,在西方人群已發(fā)現(xiàn)有7個常見的基因多態(tài)性,其中第45位密碼子(GCG→GCA)和第769位密碼子(CTT→CTG)的基因多態(tài)性與HD表型顯著相關(guān)[1,2],但由于遺傳背景等方面的差異,這一點需要在不同的人種和種族中進行證實,而有關(guān)RET基因多態(tài)性及基因頻率在亞洲人群中的分布還未見報道。 鑒于還無亞洲人群的RET基因多態(tài)性及其與HD的相關(guān)性研究,研究應用PCR-RELP在中國人群中檢測對照組(n=122)及散發(fā)性先天性巨結(jié)腸組(n=94)G45A(GCG→GCA)、T769G(CTT→CTG)、G691A(GGT→AGT)和C904G(TCC→TCG)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)分析了94例HD患者和122例健康人其中G45A(GCG→GCA),T769G(CTT→CTG),G691A(GGT→AGT)和C904G(TCC→TCG)四個位點的基因多態(tài)性,探討其基因多態(tài)性與先天性巨結(jié)腸的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)G45A、T769G和G691A在中國人群中均存在多態(tài)性,但未發(fā)現(xiàn)C904G在中國人群中存在基因多態(tài)性,均為CC型。G45A在正常對照和疾病組中基因型頻率分別為:對照組,AA 0.17、AG 0.72、GG 0.11,突變型A和野生型G等位基因的頻率為0.53、0.47;HD組,AA 0.61、AG 0.35、GG 0.04,突變型A和野生型G等位基因的頻率為0.78、0.22;T769G在正常對照和疾病組中基因型頻率分布分別為:對照組,GG 0.30、GT 0.52、TT0.18,G和T等位基因的頻率為0.56、0.44;HD組,GG 0.49、GT 0.36、TT 0.15,突變型G和野生型T等位基因的頻率為0.67、0.33。兩個位點的基因型和等位基因的分布頻率在兩組間均有顯著性差異(ax2=28.64,p0.001;bx2=5.27,p=0.022)。G691A在正常對照和疾病組中基因型頻率分別為:對照組,AA 0.05、AG 0.16、GG 0.79,突變型A和野生型G等位基因的頻率為0.13、0.87;HD組,AA 0.02、AG 0.14、GG 0.84,突變型A和野生型G等位基因的頻率為0.09、0.91,在兩組間未見有顯著性差異(cx2=1.232,p=0.267)。結(jié)果表明RET密碼子904在中國人群中可能不存在基因多態(tài)性,未發(fā)現(xiàn)G691A與先天性巨結(jié)腸存在相關(guān)性,而G45A和T769G的基因多態(tài)性可能與中國漢族人群先天性巨結(jié)腸相關(guān)。 三、RET基因啟動子單核苷酸多態(tài)性對基因表達影響的研究 胚胎發(fā)育期間RET信號傳導通路的激活對于腸神經(jīng)系統(tǒng)前體干細胞的定向遷移是非常重要的。在家族性和散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥病例中均發(fā)現(xiàn)有不同頻率的RET基因功能散失性的胚系突變。而且在白種人群和本實驗第二部分中均證實在先天性巨結(jié)腸癥病患中RET基因上的一些基因多態(tài)性的等位基因存在過度表達或降低表達的現(xiàn)象。 基因啟動子區(qū)域的某些特定的等位基因能影響基因的表達,因而可能導致一些復雜疾病的易患性。本課題擴增RET基因上游啟動子區(qū)域的片段,克隆入pGEM-T載體,用pfx高保真酶測序進行單核苷酸多態(tài)性檢測(SNP),發(fā)現(xiàn)在中國湖北地區(qū)漢族人群中,啟動子-6存在GA單核苷酸多態(tài)性。并通過測序?qū)z測到的單核苷酸多態(tài)性的純合子區(qū)分出來(-6AA或-6GG),進而構(gòu)建雙重蟲熒光素酶報告基因系統(tǒng)研究這個SNP對基因轉(zhuǎn)錄的影響。即分別構(gòu)建含有這個單核苷酸多態(tài)性位點純合子的蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒A-pGL3 Basic和B-pGL3 Basic,并將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細胞瘤細胞IMR32,檢測兩個體系的蟲熒光素酶相對表達量。結(jié)果,含A純合子等位基因啟動子的IMR32熒光素酶相對表達量為1.58±0.15,含G純合子等位基因啟動子的IMR32熒光素酶相對表達量為4.14±0.35,G等位基因?qū)epG2熒光素酶相對表達量的影響明顯高于A等位基因(p0.001),說明-6GA單核苷酸多態(tài)性與RET啟動子的活性密切相關(guān),能影響mRNA的轉(zhuǎn)錄。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2006
【中圖分類】：R726.5
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
引言
技術(shù)路線
第一部分 細胞粘附分子CAMs在先天性巨結(jié)腸癥(HD)中表達的研究
    1. 材料和方法
    2. 結(jié)果
    3. 討論
    4. 參考文獻
第二部分 RET基因多態(tài)性與中國湖北地區(qū)漢族人群先天性巨結(jié)腸癥的相關(guān)性研究
    1. 材料和方法
    2. 結(jié)果
    3. 討論
    4. 參考文獻
第三部分 RET上游啟動子-6G/A多態(tài)性對RET表達影響的研究
    1. 材料和方法
    2. 結(jié)果
    3. 討論
    4. 參考文獻
綜述 先天性巨結(jié)腸癥基礎(chǔ)研究進展
在校期間參與課題、項目及發(fā)表文章情況
致謝

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 段降龍;先天性巨結(jié)腸癥的分子遺傳學研究進展[J];中華小兒外科雜志;2002年04期

2 杜寒松;王國斌;張穎;陶凱雄;湯紹濤;牛彥鋒;;RET基因多態(tài)性與中國湖北地區(qū)漢族人群先天性巨結(jié)腸的相關(guān)性研究[J];中華胃腸外科雜志;2006年02期

本文編號：2838281